Resumen de Bluetongue infection in red deer

Caterina Falconi

• Introducción La lengua azul (LA) es una enfermedad de la lista de la Office International des Epizooties que afecta a rumiantes domésticos y salvajes y también a camélidos (MacLachlan, 1994). La LA está causada por el virus de la lengua azul (VLA), un virus RNA de doble cadena perteneciente al género Orbivirus (familia Reoviridae) con 26 diferentes serotipos (Hofmann et al., 2008; Chaignat et al., 2009; Maan et al., 2012; Batten et al., 2013)y transmitido por varias especies de dípteros del género Culicoides (familia Ceratopogonidae) (Mertens et al., 2005). En el ciclo de transmisión del VLA pueden participar varias especies de hospedadores y vectores. Diversas especies de rumiantes salvajes pueden infectarse con el VLA, sea clínicamente o de manera asintomática (Robinson et al., 1967; Fernández-Pacheco et al., 2008; Howerth et al., 2001; Tessaro and Clavijo, 2001; Bender et al., 2003; Barzilai and Tadmor, 1972), como ocurre con el ciervo (Cervus elaphus) (García et al., 2009; Rossi et al., 2009; Ruiz-Fons et al., 2008). El ciervo es una especie ampliamente distribuida y abundante en Europa (Lovari et al., 2008) susceptible de infectarse con el VLA (Linden et al., 2008; Ruiz-Fons et al., 2008; Rossi et al., 2009; Rodríguez-Sánchez et al., 2010), y que por lo tanto puede ser relevante en la transmisión y el mantenimiento del VLA. En Europa se han implementado medidas de control de la LA para los rumiantes domésticos, pero no se ha considerado su aplicación en las especies de rumiantes salvajes hospedadoras del VLA. La elevada densidad de ciervo en libertad en algunas regiones europeas ha generado preocupación acerca de la posibilidad de que los rumiantes salvajes puedan mantener o diseminar el virus en Europa. La densidad de las poblaciones de ciervo en Europa es similar a la del ganado doméstico en algunas áreas (Acevedo et al. 2008), y el ciervo puede llegar a constituir un porcentaje significativo de la población de rumiantes susceptibles a la infección por el VLA en determinadas regiones. En Europa, se han encontrado prevalencias elevadas de anticuerpos frente al VLA en ciervos, y se ha detectado repetidamente ARN de los serotipos 1, 4 y 8 del VLA mediante RT-PCR en ciervos infectados naturalmente (Garcia et al., 2009; Linden et al., 2008; Ruiz-Fons et al., 2008; Rossi et al., 2009; Rodríguez-Sánchez et al., 2010). Los estudios epidemiológicos indican que hay más casos de LA en rumiantes domésticos en las áreas con presencia de ciervo (Arenas-Montes et al., 2010). La densidad de vectores y hospedadores y los factores ambientales determinan la distribución espacial de la LA (Sleeman et al., 2009). Por lo tanto, el ciervo puede participar en la epidemiología del VLA en Europa, aún por aclarar completamente, y podría complicar el control de la LA en rumiantes domésticos. No obstante, para confirmar esta hipótesis es necesario continuar investigando la interfase entre hospedador, vector y agente patógeno, así como la epidemiología de la LA y los vectores de LA en los hábitats ocupados por la fauna salvaje. Contenido de la investigación Esta tesis investiga la posible importancia del ciervo en la epidemiología de la LA en Europa, intentando proporcionar nuevas perspectivas sobre su potencial capacidad como reservorio del virus de la lengua azul Se han estudiado tres diferentes aspectos de la interfase entre el hospedador y el virus de la lengua azul: 1. Un estudio epidemiológico en la población salvaje en libertad de ciervo 2. Una infección experimental de ciervos con VLA 3. Un estudio de la respuesta genómica del ciervo infectados con el VLA El estudio epidemiologico se llevo a cabo en una población salvaje en libertad de ciervo (Cervus elaphus) en el Parque Nacional de Cabañeros (PNC) (España) durante las epizootias de VLA-4 y VLA-1. Se obtuvieron muestras de sangre de 2885 ciervos salvajes desde 2005 a 2010 en el PNC y las fincas cinegéticas adyacentes. Se analizaron todos los sueros mediante ELISA. Las muestras positivas a ELISA se analizaron mediante seroneutralización y mediante RT-PCR. Se encontraron anticuerpos contra el VLA en 371 (12.9%) de los 2885 ciervos analizados (35/208 gabatos, 307/2542 adultos y 29/135 indeterminados). La prevalencia aumentó en los ciervos adultos desde el periodo 2005¿2006 al periodo 2008¿2009, para disminuir posteriormente. No se encontraron muestras positivas al VLA-1 mediante seroneutralización, mientras que en 43 ciervos (38 adultos, cuatro gabatos y un indeterminado) se encontraron anticuerpos específicos frente al VLA-4. No se encontró ARN del VLA en ningún ciervo. La detección de anticuerpos a lo largo de todo el periodo de estudio, especialmente en gabatos, sugiere el mantenimiento de la circulación del VLA en la población de ciervo del PNC. Sin embargo, la falta de detección de ARN del VLA sugiere que el riesgo de transmisión al ganado doméstico no es elevado. Para la infección experimental de ciervos con VLA se selecciónaron once ciervas de 8-10 meses de edad en la granja de Albacete. Tras comprobar que las ciervas eran negativas a VLA se trasladaron al laboratorio de nivel de bioseguridad 3 (LNB3) del Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) de Madrid. Ocho ciervas se infectaron con los serotipos 1 y 8 del virus de la lengua azul (cuatro con el serotipo 1 y cuatro con el serotipo 8). Las otras tres ciervas actuaron como controles negativos. Tras la infección experimental, se exploraron y se tomaron muestras de sangre con EDTA como anticoagulante y sin anticoagulante todos los dias entre el día 0 y el 12 día después de la infección y a los días 14, 17, 21, 24, 28, 31, 38, 50, 60, 66, 71, y 78 después de la infección. Las ciervas se sacrificaron los día 98, 105 y 112 post infección. Este estudio demuestra por primera vez que se puede detectar ARN del VLA en la sangre de ciervo durante largos periodos, comparables a los de los rumiantes domésticos, después de la infección experimental con VLA-1 y VLA-8. Se detectó ARN del VLA en ciervos infectados experimentalmente hasta el final del estudio (98¿112 días después de la infección experimental). Se encontraron anticuerpos específicos frente al VLA en el suero tanto mediante ELISA como mediante seroneutralización a partir de los días 8 a 12 dpi hasta el final del estudio, con un pico a los 17-28 dpi. También se registró la transmisión del VLA en ausencia de vectores en condiciones de estabulación. Estos resultados indican que el ciervo puede infectarse con el VLA y mantener ARN de VLA durante periodos largos, permaneciendo asintomático. Así, las poblaciones de ciervo sin vacunar tiene en potencial para actuar como reservorio de la LA en Europa, y podrían poner en riesgo el éxito de la estrategia europea de control del VLA. Por lo tanto, hay que tener en cuenta las poblaciones de ciervo (tanto en libertad como en granja) en los programas de vigilancia del VLA, y adaptar los esquemas de vacunación y restricción de movimientos aplicados al ganado doméstico para incluir a los ciervos estabulados o transportados. Finalmente, en el estudio de la respuesta genómica del ciervo, se analiza la expresión génica diferencial en biopsias cutáneas de hembras de ciervo (Cervus elaphus) infectadas experimentalmente con VLA-1 y VLA-8. Se obtuvieron biopsias cutáneas de hembras de ciervo infectadas experimentalmente y control 14 y 98 días después de la infección experimental. El perfil de la expresión génica global en respuesta a la infección por el VLA se caracterizó a los 14 dpi utilizando microarrays bovinos junto con un análisis mediante RT-PCR a tiempo real de los genes expresados diferencialmente a los 14 y 98 dpi. La expresión de dieciocho genes aumentó y la de tres disminuyó como respuesta a la infección con el VLA, sin que hubiera diferencias significativas entre las hembras de ciervo infectadas con el VLA-1 y las infectadas con el VLA-8. Siete genes, seis cuya expresión aumentó (ISG15, PSMB8, PSMB9, BOLA, C1qA, C4) y uno cuya expresión disminuyó (FOS) estaban representados en exceso después de las pruebas condicionales para la ontología génica de procesos biológicos, afectando a cinco vías moleculares implicadas en la respuesta inmune del hospedador (RIG-1, proteasoma, MHC-1, complemento, TLR). La infección por el VLA tuvo un efecto menor y transitorio en la expresión génica en las hembras de ciervo, como demuestran los pocos genes que se expresaron de manera diferente en respuesta a la infección por el VLA a los 14 dpi, y la mayoría tuvieron niveles de expresión similares entre animales infectados y no infectados a los 98 dpi. Estos resultados sugieren que el ciervo podría controlas la infección por el VLA con poco efecto sobre las vías moleculares del hospedador. Conclusión Estos resultados indican que el ciervo puede infectarse con el VLA y mantener ARN de VLA durante periodos largos, permaneciendo asintomático. Así, las poblaciones de ciervo sin vacunar tiene en potencial para actuar como reservorio de la LA en Europa, y podrían poner en riesgo el éxito de la estrategia europea de control del VLA. Por lo tanto, hay que tener en cuenta las poblaciones de ciervo (tanto en libertad como en granja) en los programas de vigilancia del VLA, y adaptar los esquemas de vacunación y restricción de movimientos aplicados al ganado doméstico para incluir a los ciervos estabulados o transportados. Bibliografía Acevedo, P., Ruiz-Fons, F., Vicente, J., Reyes-Garcia, A.R., Alzaga, V., Gortazar, C. 2008. Estimating red deer abundance in a wide range of management situations in Mediterranean habitats. Journal of Zoology 276, 37¿47. Arenas-Montes, A., Borge, C., Carbonero, A., Perea, A., González, M.A., Cadenas, R., Zorrilla, I., Arenas, A., García-Bocanegra, I. 2010. Maintenance du sérotype 1 du virus de la Fievre Catarrhale Ovine ches les ruminants sauvages dans l sud de l¿Espagne. In: Proceedings of the 28émes Rencontres du Groupe d¿Etudes sur l¿Ecopathologie de la Faune Sauvage de Montagne (GEEFSM), Rocchetta Nervina, Italy, 10¿13 de June 2010. Barzilai, T.E., Tadmor, A. 1972. 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