Resumen de Nuevas sondas fotoactivas para el estudio de sistemas supramoleculares basados en ácidos biliares
Los ácidos biliares (ABs) son una familia de esteroides solubles en agua biosintetizados en los hepatocitos del hígado a partir del colesterol.1,2 Químicamente, los ABs poseen como estructura básica un sistema de anillos de pentanoperhidrofenantreno,3 con una fusión inusual cis entre los anillos A y B, dos metilos angulares, una cadena corta de cinco átomos de carbono con un grupo carboxilo terminal y un número variable de grupos hidroxilo en la cara ¿. Como consecuencia de esta inusual estructura, los ABs exhiben anfifilia facial; así, su cara ß convexa posee carácter hidrofóbico, mientras que la cara cóncava ¿¿muestra un carácter más hidrofílico;4,5 favoreciendo la formación de agregados que aumentan de tamaño con la concentración en disolución acuosa. Los ácidos biliares actúan como tensoactivos para facilitar la digestión de grasas, colesterol y lípidos6,7 mediante la formación de agregados y micelas mixtas,8-11 entre otras funciones.12,13 Las funciones fisiológicas de los ABs en el organismo son variadas y cada vez se recurre al uso de técnicas más precisas para su estudio. Los aspectos estructurales y fisiológicos de los ABs, tales como su biosíntesis en los hepatocitos del hígado14 y almacenamiento en la bilis, así como su transporte a través de la circulación enterohepática o su participación en la absorción de lípidos y grasas han sido sólo parcialmente estudiados. En la presente tesis doctoral se planteó el empleo de técnicas fotofísicas tales como fluorescencia y fotólisis de destello láser, aplicadas a nuevos derivados fotoactivos de ácidos biliares y colesterol, para investigar las propiedades de diferentes sistemas supramoleculares como agregados o micelas mixtas y avanzar en el conocimiento de algunas de las funciones de los ácidos biliares y sus aplicaciones. Para ello, en primer lugar, fue necesario sintetizar nuevos derivados fotoactivos de ácido cólico y colesterol empleando fluoróforos que alteraran mínimamente las propiedades inherentes al esqueleto esteroidal de los mismos. Así, se prepararon nuevos derivados del ácido cólico y del colesterol empleando diferentes fluoróforos tales como dansilo (Dns), naproxeno (NPX) y triptófano (Trp). Para los derivados de ácido cólico, éste se transformó en amino intermedios en las posiciones 3¿-, 3ß- o 7¿-. A partir de éstos se sintetizaron los derivados de dansilo en las tres posiciones, y el derivado 3ß-naproxeno. Los derivados 3ß- y 7¿-dansilo también se utilizaron para unir covalentemente triptófano a la cadena lateral. Además, se prepararon otras dos díadas de triptófano, una de ellos uniendo el cromóforo por el grupo carboxilo del ácido cólico en ausencia de dansilo y otra uniendo directamente triptófano y dansilo. Por otra parte, las nuevas díadas de colesterol se prepararon mediante esterificación directa con los cromóforos dansilo o naproxeno. A continuación, se estudiaron las propiedades fotofísicas de su estado fundamental, así como de sus estados excitados singlete y triplete. La unión covalente del fluoróforo dansilo en las posiciones 3¿-, 3ß- o 7¿- del ácido cólico proporcionó sondas fluorescentes cuyas propiedades dependieron fuertemente del medio. Así se observó un desplazamiento hipsocrómico de la posición del máximo de emisión tras su incorporación a los agregados. Además, el rendimiento cuántico de emisión y el tiempo de vida de fluorescencia aumentaron más de tres veces respecto a los valores obtenidos en disolución para los derivados 3¿- y 3ß-. El análisis combinado de los experimentos en estado estacionario y tiempo resuelto permitió investigar la agregación de las sales biliares más abundantes, proporcionando información clave para construir los diagramas de especiación. Éstos revelaron diferencias en las concentraciones de comienzo de formación de los agregados, siendo mayores, conforme se aumentaba la lipofilia de la sal biliar. Posteriormente, el empleo de derivados de dansilo y/o naproxeno unidos covalentemente al ácido cólico y/o colesterol ha demostrado la incorporación de ambos en la arquitectura supramolecular proporcionada por las micelas mixtas mediante la utilización de técnicas fotofísicas. La sustitución de un porcentaje inferior al 5% de los componentes originales de la micela mixta por los dansil derivados de ácido cólico o colesterol resultó en un gran aumento de la intensidad de fluorescencia, así como del tiempo de vida de singlete. El tiempo de triplete de las díadas marcadas con naproxeno aumentó en un orden de magnitud en micela mixta. Por otra parte, se demostró la utilidad de las técnicas fotofísicas para evaluar el potencial de los agregados de ácidos biliares como transportadores de fármacos. Para ello, se evaluó la diferente distribución de las sondas entre la disolución y los agregados mediante el estudio de la desactivación de singlete y triplete por yoduro y nitrito, respectivamente, de los dos enantiómeros del antiinflamatorio no esteroideo (R)- y (S)-NPX, así como de sus ésteres metílicos (R)- y (S)-NPXMe. Mientras que en disolución se observaron constantes de desactivación de singlete eficientes (~109 M-1 s-1), éstas se vieron reducidas en un orden de magnitud (~108 M-1 s-1) cuando las sondas eran incorporadas a los agregados. Se observó que las sondas más hidrofóbicas ((R)- o (S)-NPXMe) se incorporaban en los agregados a partir de 50 mM de colato sódico, mientras que las sondas más hidrofílicas ((R)- o (S)-NPX) se incorporaron, en un porcentaje superior al 95%, solo a partir de 250 mM de CA. El estudio mediante fotólisis de destello láser reveló la misma tendencia en la desactivación por nitrito del triplete de las sondas, indicando que ambas técnicas son herramientas que nos permiten evaluar la incorporación a los agregados. Finalmente, se utilizaron los diferentes sistemas supramoleculares caracterizados durante la tesis doctoral (diferentes agregados de sales biliares y micelas mixtas) para estudiar procesos de desactivación de fluorescencia. La desactivación del singlete en diferentes derivados de triptófano o dansilo por yoduro fue muy efectiva en disolución para todos los casos (~ 109 M-1 s-1 para los derivados de triptófano y ~ 7,0 x 108 M-1 s-1 para dansilo) y disminuyó gradualmente conforme los fluoróforos se incorporaron en el interior de los agregados. Para asegurar la incorporación de las dos sondas al mismo tipo de entorno y estudiar simultáneamente en ambos cromóforos la desactivación del singlete, se prepararon díadas que contenían ambos en la misma molécula de ácido cólico. En concreto se prepararon nuevos derivados fotoactivos de ácido cólico mediante la unión covalente de dansilo en posiciones C-3 o C-7 y triptófano en la cadena lateral (3ß-Dns-CA-Trp, 7¿-Dns-CA-TrpMe, respectivamente). Los espectros de emisión de estas nuevas díadas revelaron que para 7¿-Dns-CA-TrpMe se producía un proceso de transferencia de energía total desde el triptófano al dansilo, mientras que para 7¿-Dns-CA-TrpMe, la transferencia resultó ser parcial. Asumiendo un mecanismo de tipo Förster, se estimó la distancia entre ambos cromóforos en la díada 3ß-Dns-CA-Trp, resultando del orden de 30 Å. Por otra parte, se eligió el derivado 3ß-Dns-CA-Trp para estudiar la desactivación de la fluorescencia en diferentes agregados de sales biliares y micelas mixtas y se observó desactivación del singlete por yoduro en todos los sistemas supramoleculares. La constante de desactivación decreció con la misma tendencia para ambos cromóforos conforme se aumentó la lipofilia del entorno, alcanzando valores de un orden de magnitud inferiores a los obtenidos en disolución. En conclusión, de la presente tesis doctoral, que versa sobre la utilidad de las técnicas fotofísicas, aplicadas a derivados fotoactivos de los ácidos biliares y colesterol para investigar algunas de sus características y funciones, se ha podido investigar acerca de la agregación de los ácidos biliares y determinar sus diagramas de especiación mediante el empleo de derivados fotoactivos de ácido cólico y el análisis combinado de la variación relativa de la fluorescencia en estado estacionario y tiempo resuelto. Además, empleando sondas fotoactivas mediante la unión covalente de dansilo o naproxeno al esqueleto esteroideo de ácido cólico y colesterol y mediante el estudio de sus estados excitados singlete y triplete, se ha estudiado la incorporación de ácido cólico y colesterol en micelas mixtas. Por otro lado, se han utilizado los agregados de ácidos biliares y las micelas mixtas como sistemas supramoleculares de estudio donde investigar acerca de la capacidad de los agregados de ácido cólico como transportadores de fármacos mediante el empleo de fármacos con diferente hidrofobicidad y como ejemplo modelo para el estudio de procesos de desactivación de la fluorescencia y de transferencia de energía.Así, la unión covalente de dansilo en posiciones 3ß- o 7¿- del ácido cólico y de triptófano en la cadena lateral, proporcionó modelos adecuados para estudiar simultáneamente procesos de desactivación de la fluorescencia inter e intramolecular en disolución y en diferentes entornos supramoleculares. (1) Hofmann, A. F. Archives of Internal Medicine 1999, 159, 2647. (2) Hofmann, A. F.; Hagey, L. R. Cellular and Molecular Life Sciences 2008, 65, 2461. (3) Nair, P. P. K., D. The Bile Acid's Chemistry, Physiology and Metabolism Plenum Press: NY, 1971; Vol. 1. (4) Hofmann, A. F. News Physiol. Sci. 1999, 14, 24. (5) Bohne, C. Langmuir 2006, 22, 9100. (6) Carey, M. C. S., D. M. Am. J. Med. 1970, 49, 590. (7) Carey, M. C. S., D. M. Arch. Intern. Med. 1972, 130, 506. (8) Porter, C. J. H.; Trevaskis, N. L.; Charman, W. N. Nature Reviews Drug Discovery 2007, 6, 231. (9) Wang, Q. D.; Cui, D. F.; Lin, Q. H. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1997, 1324, 69. (10) Luk, A. S.; Kaler, E. W.; Lee, S. P. Biochemistry 1997, 36, 5633. (11) Nagadome, S.; Numata, O.; Sugihara, G.; Sasaki, Y.; Igimi, H. Colloid and Polymer Science 1995, 273, 675. (12) Structure-Performance Relationships in Surfactants; 1 ed.; Esumi, K. U., M., Ed.; Marcel and Dekker: New York, 1997. (13) Wiedmann, T. S.; Kamel, L. Journal of Pharmaceutical Sciences 2002, 91, 1743. (14) Wieland, H. Angewandte Chemie 1929, 4, 421.
