Resumen de Análisis de los mecanismos de respuesta a bajas temperaturas y a estrés del retículo endoplásmico
A lo largo de los años, la levadura S. cerevisiae se ha convertido en organismo modelo tanto en la industria, como en el campo de la investigación básica, debido a sus características metabólicas y su fácil manipulación. Es conocido que, cuando la célula se enfrenta a una situación de estrés, debe modificar su fisiología para mantener la homeostasis celular. Esta adaptación incluye la regulación del repertorio de proteínas, eliminando aquellas que ya no son necesarias o sintetizando otras nuevas. En este proceso, un orgánulo crucial es el retículo endoplásmico, que establece un punto de control en la calidad de las proteínas, ya que es el responsable de su glicosilación y correcto plegamiento. Cuando se acumulan proteínas mal plegadas, se produce el así llamado estrés del RE y la supervivencia de la célula se ve comprometida. En esta situación se sabe que se activan mecanismos de respuesta específicos como la UPR, pero hay evidencias de la existencia de un sistema más complejo, en el que participan otras rutas, como es el caso de la ruta de integridad de la pared celular (Scrimale y col., 2009) o la ruta HOG (Chen y col., 2005), aunque la implicación de esta última no se ha analizado en profundidad. En el ámbito industrial, el aumento en la demanda de levaduras con características especiales, ha hecho patente la necesidad de nuevas cepas que se adecuen a los requerimientos y necesidades del consumidor. En esta línea, las estrategias de mejora y selección de cepas industriales se ven limitadas por el escaso conocimiento que disponemos de la respuesta de la levadura a condiciones de estrés, por lo que, un mejor entendimiento de la fisiología y de los determinantes genéticos y moleculares responsables de la respuesta de S. cerevisiae, es crucial para establecer las estrategias a seguir. En concreto, la industria panadera ha experimentado un aumento en la producción de masas congeladas, dejando en evidencia la falta de levaduras resistentes a congelación, mientras que en el caso de las levaduras vínicas, urge el desarrollo de cepas capaces de fermentar a bajas temperaturas para la elaboración de vinos blancos y rosados. Sin embargo, S. cerevisiae no fermenta bien en dichas condiciones, por lo que es importante aumentar su adaptación a frío y tolerancia a congelación. El estrés generado por bajas temperaturas es complejo y multifactorial y está relacionado con otros estreses. Estudios anteriores, demuestran que la exposición de la levadura a bajas temperaturas, activa mecanismos de señalización y de transducción, que determinan la capacidad de la célula para adaptarse y sobrevivir. Es el caso de la ruta HOG, cuya activación en frío es necesaria para la producción de glicerol, el cual actúa como crioprotector. Aunque los mecanismos sensores encargados de percibir el descenso de la temperatura no están bien establecidos, todos los datos apuntan a cambios físicos en la membrana plasmática. Al ser ésta la primera barrera de la célula, es importante conocer las bases moleculares de su funcionalidad y en qué modo su estructura y composición influye en la adaptación celular a bajas temperaturas. Actualmente, ya no se concibe a la membrana como simétrica, sino como una red de subdominios, que establecen microambientes para las proteínas embebidas en ella y que están relacionados entre sí o con complejos proteicos asociados a ellos. Es el caso de los MCCs y los eisosomas; éstos últimos implicados en procesos de endocitosis y señalización. Sin embargo, puesto que este es un campo de investigación relativamente reciente, aún quedan muchos aspectos de su regulación que permanecen sin esclarecer. En este trabajo de tesis nos hemos centrado en ampliar el conocimiento sobre la respuesta celular frente a estrés del RE o por exposición a bajas temperaturas. Cabe destacar que el estudio de la respuesta a estas situaciones es complejo y a menudo, cada resultado obtenido plantea nuevas preguntas. Nuestros resultados inciden en la idea de que la MAP quinasa Hog1p responde a numerosas situaciones de estrés, incluyendo la acumulación de proteínas mal plegadas y modula respuestas a diferentes niveles, desde la transcripción a la modificación post-traduccional. En el presente trabajo, hemos presentado evidencias de que la actividad de Hog1p regula varios procesos citosólicos en respuesta a la exposición a tunicamicina, entre ellos el estado de fosforilación de Tdh3p y la recuperación de los niveles de traducción, aunque no hemos podido establecer datos sólidos sobre el papel funcional de estos cambios en la capacidad de supervivencia y adaptación de S. cerevisiae a este estrés y quizás a otros en los que sólo la actividad nuclear de Hog1p ha sido investigada. En cuanto a la respuesta a bajas temperaturas, el rastreo realizado hace énfasis en la importancia de la maquinaria endocítica en la sensibiliadad a frío de S. cerevisiae y desvela por primera vez la implicación de proteínas encargadas de regular el repertorio de proteínas de membrana y la organización asimétrica de lípidos. Al llevar a cabo un rastreo en condiciones tan concretas como baja temperatura y la adición de fitoesfingosina, esperábamos aislar proteínas cuya función estuviera relacionada con la regulación de la estabilidad de la membrana plasmática. En este sentido, la identificación de una serie de genes implicados directa o indirectamente en el proceso de ubicuitilación y por lo tanto en regular el repertorio de proteínas de la célula, ha validado la estrategia empleada y abre una vía para el estudio del papel de cada una de ellas en la endocitosis en levadura. Además, con este trabajo hemos aportado nuevos datos sobre el papel de ciertas proteínas en la regulación de la abundancia de permeasas de membrana. En concreto, nuestros resultados sugieren que la degradación específica de Tat2p, es la causa principal de la inhibición en el crecimiento observada a bajas temperaturas. La presencia de una mayor cantidad de esta permeasa, debido a la sobreexpresión de Aly2p, mejora la capacidad de la célula para crecer en estas condiciones. No obstante, no podemos descartar que estas proteínas actúen sobre otros transportadores no incluidos en nuestro análisis, por lo que, es necesario un estudio más amplio. Nos preguntamos también por qué la exposición a frío dispara la degradación de transportadores de nutrientes a favor de su biosíntesis y si esto supone una ventaja para S. cerevisiae en su lucha por adaptarse a temperaturas muy por debajo de la óptima de crecimiento. En el caso de la identificación de Sng1p como supresor del fenotipo a bajas temperaturas y su relación con la actividad Pkh, se abren nuevos campos de investigación. Por un lado, que el efecto de la sobreexpresión de SNG1 dependa de la actividad de las proteína quinasas Pkh1-3p, pero no de Fpk1,2p podría indicar una vía alternativa de regulación de la actividad flipasa, no descrita previamente. Por otro lado, nuestro análisis establece la interacción de Sng1p con Nce102p, su participación en la regulación de la actividad Pkh y como ésta afecta a la actividad flipasa. Queda por aclarar el posible papel de Sng1p como sensor del nivel de esfingolípidos junto con Nce102p y si, como se ha descrito para Nce102p, esta proteína se mueve entre diferentes micro-ambientes de la membrana en relación al nivel de esfingolípidos. Por otra parte, nuestros resultados no revelan si Sng1p ejerce su función inhibidora a nivel de las Pkhs o de las Ypks y así, es posible que Sng1p y Nce102p pudieran tener diferentes substratos. También, es posible que dado el carácter pleiotrópico del modulo Pkh-Ypk, Sng1p y Nce102p regulen su actividad en respuesta a estímulos comunes, pero también específicos. Además, las proteínas Pkh1,2p están implicadas en procesos muy variados en los que sería interesante estudiar la posible intervención de Sng1p. Por último, la observación de que la ausencia de las flipasas Dnf1,2p o de sus proteína quinasas reguladoras Fpk1,2p, estimula el crecimiento a 12ºC, plantea la cuestión de si la regulación de la asimetría de aminofosfolípidos de membrana podría ser un mecanismo celular diseñado para contrarrestar, al menos en parte, los efectos negativos de una una rigidificación de los lípidos de membrana. Conviene recordar que un descenso de la temperatura ambiental, aumenta el contenido de ácidos grasos insaturados o de menor longitud de cadena, si bien estos cambios y otros descritos en la composición de clases y sub-clases de lípidos no son suficientes para explicar el comportamiento en frío de cepas tolerantes y sensibles de S. cerevisiae.
