Tick proteomics: Understanding tick physiology, evolution and control
- Autores: Marina Popara
- Directores de la Tesis: José de la Fuente García (dir. tes.), Margarita M. Villar Rayo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ana Isabel Marina Ramírez (presid.), Maria Pilar Alberdi Velez (secret.), Consuelo Almazán (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: RUIdeRA
- Resumen
En la era post-genómica, la proteómica incluye estrategias prometedoras para caracterizar las interacciones dinámicas que no pueden ser analizados mediante un enfoque genómico o transcriptómico. La aplicación de la proteómica en la investigación de garrapatas se encuentra en sus comienzos y es necesario continuar en la misma para alcanzar el pleno potencial de esta tecnología. Debido a esto, el presente trabajo se ha centrado el desarrollo de nuevas estrategias proteómicas y su aplicación para profundizar en la comprensión de las interacciones garrapata-hospedador-patógeno. En el transcurso de esta tesis doctoral, los estudios de biología de sistemas, basados principalmente en aproximaciones proteómicas, complementados con transcriptómica y estudios inmunológicos, que se han llevado a cabo han permitido la identificación de proteínas expresadas diferencialmente en diferentes especies de garrapatas que han conducido a una mejor comprensión tanto de la biología de la garrapata, como de su desarrollo y la evolución. Contenido de la investigación Debido al limitado número de estudios que se han llevado a cabo aplicando la proteómica a la investigación de garrapatas, tuvieron que desarrollarse nuevos protocolos para la extracción y el análisis de proteínas durante el curso de este trabajo, poniendo especial énfasis en el trabajo con muestras de garrapatas repletas recogidas después de alimentarse sobre hospedadodes vertebrados. En esta tesis, la proteómica se aplicó al estudio de la biología, el desarrollo y la evolución de las garrapatas. En la primera parte se recogió el primer estudio realizado sobre el proteoma de las especies más importantes de garrapatas del género Amblyomma. Los resultados obtenidos proporcionan nueva información para entender la fisiología, el desarrollo y la evolución de estas especies de garrapatas. La filoproteómica llevada a cabo utilizando la secuenciación de novo de proteínas se ensayó como un nuevo enfoque para el análisis filogenético de las especies de garrapatas en las que los datos de secuencia son un factor limitante. En la segunda parte, se recogieron las investigaciones realizadas sobre larvas no alimentadas de D. reticulatus cuyos resultados apoyan el uso de la secuenciación paired-end para el análisis de los datos de transcriptómica. Por otra parte, la aproximación PIT (proteomics informed by transcriptomics) mostró una alta eficiencia en la identificación de proteínas utilizando una base de datos creada a partir de los datos de transcriptómica para buscar los espectros de masas, confirmando ser una buena alternativa para organismos con poca información de secuencia disponible, tales como D. reticulatus. Los procesos que se identificaron como más activos fueron procesos metabólicos y celulares que implican reacciones enzimáticas, lo que sugiere que las garrapatas son muy activas durante esta etapa de la vida. Se reveló también que las respuestas de estrés estaban activas en D. reticulatus larvas sin alimentar, probablemente para contrarrestar el efecto negativo de la temperatura y otras condiciones de estrés tales como la infección por Rickettsia y favoreciendo la adaptación de la garrapata a las condiciones ambientales para aumentar su supervivencia. Estos resultados muestran los mecanismos que se han desarrollado en las garrapatas D. reticulatus para sobrevivir bajo condiciones de estrés y sugieren que se conservan en las especies de garrapatas duras. Hay muy pocos estudios que han investigado el efecto de un hospedador específico sobre la biología garrapatas. La existencia de factores del hospedador que afectan a la alimentación y la reproducción de la garrapata, así como el impacto sobre la evolución y la ecología del vector se puso al descubierto en estudio realizado comparando los proteomas de Rhipicephalus microplus alimentados sobre ganado bovino o sobre el venado cola blanca (VCB). Las garrapatas R. microplus alimentadas en bovinos presentaban una sobre-expresión de proteínas implicadas en la digestión de la sangre y la reproducción comparadas con las garrapatas alimentadas sobre VCB, correlacionándose con valores mayores respecto al número de garrapatas, peso y rendimiento reproductivo observados. Estas garrapatas probablemente ingieren más sangre, como se refleja en mayores pesos de las garrapatas y mayor cantidad de alfa -2-macroglobulina e inmunoglobulina. Sin embargo, los niveles más altos de proteínas del hospedador, tales como hemoglobina, haptoglobina y albúmina, presentes en las garrapatas alimentadas en VCB, se correlacionan con una menor maquinaria para la digestión de la sangre presente en estas garrapatas. Los niveles de fibrinógeno en las garrapatas alimentadas en bovinos fueron mayores y pueden reflejar la respuesta del hospedador ante una infección explicando las menores infestaciones de garrapatas que se observan en ciervos, posiblemente debido a una co-evolución garrapata-hospedador. Esta tesis también presentó el potencial de la proteómica para caracterizar los mecanismos de protección de las vacunas de garrapatas. La eficacia de la vacunación con BM86 y otros antígenos de garrapata en ganado ha demostrado ser siempre superior contra R. annulatus que contra R. microplus, sugiriendo que la genética de la garrapata y/o factores fisiológicos pueden afectar la eficacia de la vacuna. Para investigar esto, se compararon los proteomas de hembras de garrapatas de las especies R. microplus y R. annulatus después de alimentarse sobre ganado bovino control y vacunado con BM86. R. annulatus mostró tener una menor cantidad de proteínas del hospedador bovino en comparación con R. microplus, sugiriendo que las garrapatas R. annulatus ingirieron una menor cantidad de sangre. Esta diferencia aumentó cuando se alimentaron sobre animales vacunados, reflejando probablemente el efecto de las interacciones anticuerpo-BM86 en este proceso. La maquinaria de degradación protéica se mostró disminuida en R. annulatus respecto a R. microplus. Tanto los niveles de ARNm como de proteína para BM86 fueron similares en ambas especies de garrapatas. Estos resultados sugieren una menor actividad de proteasas en R. annulatus, interacciones anticuerpo-antígeno más eficientes y una mayor eficacia de la vacuna indicando que no sólo las diferencias genéticas, sino también factores fisiológicos influyen en eficacia de la vacuna. La segunda parte del estudio comparó los proteomas de R. microplus alimentados sobre ciervos vacunados con BM86 y con subolesina para investigar los mecanismos responsables del diferente efecto de dos antígenos protectores de garrapatas. Los resultados mostraron que, aunque ambas vacunas reducen la alimentación de la garrapata y la reproducción, actúan a través de diferentes mecanismos de protección. El principal efecto protector de la vacuna BM86 es el efecto sobre la función y los niveles de BM86, alterando la estructura y la función intestinal garrapata y, en consecuencia, la digestión de la sangre y la reproducción. Para la vacuna SUB, la vacunación reduce los niveles de proteína y afecta a su función como un regulador transcripcional de genes implicados en varios procesos biológicos importantes para la alimentación de la garrapata y su reproducción. Conclusiónes Los resultados actuales sobre proteómica aplicada al estudio de garrapatas indica la necesidad de integrar las investigaciones transcriptómicas y proteómicas utilizando un enfoque desde la biología de sistemas. Este enfoque holístico para el estudio de las interacciones garrapata-hospedador-patógeno es fundamental para avanzar en la comprensión de las interacciones tanto garrapata-patógeno como garrapata-hospedador. Los resultados de esta tesis tienen implicaciones importantes para la investigación en interacciones garrapata-hospedador y mejora de las vacunas para el control de garrapatas, apoyando el estudio de los mecanismos moleculares asociados a la protección de la vacuna para combinar antígenos que actúan a través de diferentes mecanismos de protección para aumentar la eficacia de la vacuna. Bibliografía Almazán, C, Lagunes R, Villar M, Canales M, Rosario-Cruz R, Jongejan F, de la Fuente, J. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol Res 2010; 106:471-479. Canales M, Almazán C, Naranjo V, Jongejan F, de la Fuente J. Vaccination with recombinant Boophilus annulatus Bm86 ortholog protein, Ba86, protects cattle against B. annulatus and B. microplus infestations. BMC Biotechnol 2009; 9:29. 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