Estudi sobre l’efecte de bhrf1 en la inhibició de l’apoptosi i el control del cicle cel·lular en cèl·lules d’hibridoma

• Autores: Ernest Milián González
• Directores de la Tesis: Francesc Gòdia Casablancas (dir. tes.), Joaquim Vives Armengol (dir. tes.), Jordi Joan Cairó Badillo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Joan Xavier Comella i Carnicé (presid.), Lídia Garcia Coronado (secret.), Manuel Cascalló Piqueras (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • En l’actualitat, la industria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d’elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l’activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d’aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa a l’ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, entre les que es troba la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules en cultiu, degut a l’activació del procés de mort cel·lular programada o apoptosi. La principal causa de l’activació d’aquest tipus de mort cel·lular és l’esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l’acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula al llarg del cultiu. L’apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i, en conseqüència, la productivitat del bioreactor. En aquest treball, s’han utilitzat cèl·lules murines d’hibridoma KB26.5 productores de la immunoglobulina IgG3, transfectades amb el gen bhrf1 i s’ha comprovat com aquesta modificació és capaç de reduir el nivell de mort per apoptosi, i garantir la supervivència de les cèl·lules durant un període on hi ha una situació d’inducció a l’apoptosi. Aquesta capacitat s’ha observat en dos sistemes de cultiu cel·lular com són el discontinu i la perfusió. Aquest últim sistema de cultiu s’ha posat en evidència que, a més de conferir una major resistència a la mort cel·lular, BHRF1 afecta al cicle cel·lular tant sols en els moments de limitació de nutrients. Aquestes observacions han portat a estudiar els efectes intracel·lulars de BHRF1 per entendre com l’expressió d’aquest gen víric era capaç de produir aquests efectes fenotípics. S’ha determinat que BHRF1 no es limita tant sols a l’aturada de l’apoptosi a nivell mitocondrial, sinó que és capaç d’influir en diverses rutes que intervenen en processos vitals per la cèl·lula. Les anàlisi realitzades amb microarrays de DNA han revelat la capacitat de BHRF1 d’induir de forma diferencial l’expressió de gens relacionats amb l’apoptosi, el cicle cel·lular, la ruta Akt/mTOR i la via de JNK. A més, estudis realitzats mitjançant PCR en temps real han indicat que, tant sols en condicions inductores de l’apoptosi, es produeix una sobreexpressió de bcl2 en les cèl·lules KB26.5 transfectades amb el gen bhrf1, indicant que hi ha una relació entre les dues proteïnes codificades per aquests gens. Per tal de veure els efectes de la sobreexpressió de bcl2 s’han utilitzat inhibidors químics específics per la proteïna Bcl-2. Com a resultat s’ha anul·lat la resistència a l’apoptosi per part d’aquelles cèl·lules amb expressió de BHRF1. La sobreexpressió de bcl2 es pot relacionar, a més, amb l’aturada observada del cicle cel·lular en la fase G1. La relació entre BHRF1 i Bcl-2 no s’ha constatat a través d’una interacció directa, ja que tant sols s’han vist interaccions de BHRF1 amb la proteïna proapoptòtica Bim i amb VRK2, relacionada amb la ruta JNK. Aquestes interaccions proteiques poden explicar la conservació de la integritat mitocondrial que s’ha observat en aquelles cèl·lules amb presència de BHRF1 i la resistència a l’apoptosi en condicions d’estrès. En aquest treball s’ha determinat també que BHRF1 és una proteïna exclusivament mitocondrial, ja que aquesta no varia la seva localització cel·lular tant en un context d’alta viabilitat cel·lular com d’apoptosi, per tant les interaccions proteiques s’han de donar a nivell del mitocondri.