Desarrollo y validación de nuevas metodologías para la caracterización de la interacción de ligandos con ADN. Estudio de la unión de cromóforos catiónicos heteroaromáticos con potencialidad intercalante
- Autores: Verónica García Hernández
- Directores de la Tesis: Alberto Domingo Galán (dir. tes.), Juan J. Vaquero López (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Angel Pérez Albarsanz (presid.), Bernardo Herradón García (secret.), Beatriz de Pascual-Teresa Fernández (voc.), Enrique Pedroso Muller (voc.), Jesús Jiménez Barbero (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: e_Buah
- Resumen
- español
El diseño de compuestos con capacidad de unión a secuencias específicas de ADN tiene gran importancia en farmacología dado que existen numerosos fármacos que tienen el ADN como diana y cuya actividad terapéutica se basa en la afinidad y selectividad de su interacción con el mismo. Por otro lado, estos ligandos de bajo peso molecular con capacidad de unión a secuencias predeterminadas de ADN pueden ser herramientas de gran utilidad en biología molecular. Para comprender en toda su complejidad la interacción entre el ADN y estos ligandos se debe combinar la caracterización del mecanismo de unión a resolución prácticamente atómica, con datos termodinámicos de las energías de unión a oligonucleótidos. Existen diversos métodos para estudiar esta unión pero generalmente presentan desventajas como el alto coste por ensayo (en tiempo, reactivos o fungible), falta de sensibilidad o imposibilidad de automatización. De ahí la utilidad del objetivo principal de esta Tesis: desarrollar un ensayo rápido y eficaz, capaz de identificar el sitio preferente de interacción entre el ADN y compuestos de diferente naturaleza. A lo largo de esta Tesis se expondrá el desarrollo, validación y aplicaciones de un método novedoso, basado en el análisis de curvas de fusión de ADN y que puede ser considerado como método de alto rendimiento para cribado de un gran numero de compuestos que se unan al ADN. Este método aporta mejoras significativas en aspectos como consumo de reactivos y de tiempo por ensayo, que tradicionalmente han limitado la determinación experimental de la selectividad de secuencia ligando-ADN. Así, finalmente, ha podido aplicarse esta metodología al estudio de la interacción con ADN de una quimioteca formada por decenas de compuestos heteroaromáticos catiónicos con N cuaternario en posición cabeza de puente.
- English
The goal of promoting or repressing gene expression by low molecular weight ligands is closely related with advances in our understanding of the DNA recognition reaction. Besides, there are notable applications in molecular biology of ligands with sequence selective DNA binding. The central objective of this dissertation is to deepen in the knowledge of DNA recognition of several ligands, mainly by the development of a new miniaturised assay. Available analytical assays for the determination of the potential selectivity interaction of a particular compound to DNA suffer the drawback that none are applicable to the highthroughput screening required to explore libraries of compounds in a systematic search for new and more selective DNA binders. In the introduction to this dissertation there is a brief review of concepts, data and methodologies related with DNA binding ligands. Special focus is made with intercalative agents. In addition, we describe the development and characteristics of a method that fulfil the expected purposes and its application to almost a hundred of ligands of diverse DNA binding modes. For this screening method we use synthetic oligonucleotides containing a fluorophore attached to deoxyribose at the 5’ position in one strand and a quencher in the 3’ position of the complementary. In double strand DNA fluorescence is quenched as fluorophore and quencher are in close proximity. When the strands melt, both are separated and there is a large increase in fluorescence. Ligand presence causes an increment in the temperature at which half DNA molecules are dissociated, therefore their strands are separated (melting temperature, Tm).
These experiments are carried out in the real time thermocycler Fast-7500 Sequence Detection System from ABI-PRISM. This equipment provides us with a spectrofluorimeter where constant temperature variations can be established. It requires small amounts of material (typically 20 µl reaction mix total volume) and can perform 96 melting profiles in parallel. This makes feasible that the determination of the preferred sequence be fast, sensitive and quantitative and also allows carrying out the analysis of a high amount of specific double stranded DNA sequences. The procedure has relevant advantages comparing to DNA denaturalization detection by other techniques, like UV absorbance. Method’s utility has been validated with compounds binding DNA by different mechanisms. Thus, we have analysed minor groove DNA binding ligands (DAPI and Hoescht 33258), the monointercalative agents etidium bromide and doxorubicin, several bisintercalators (TOTO-I, thiocoraline-A and echinomycin), compounds that bind covalently to DNA (ecteinascidins and derivatives) and ligands with a complex way of DNA binding, such as the γ-carboline bis-salt AMP-10.15 or S223906-1, which binds to single-stranded DNA. For model compounds, results are consistent with those obtained by traditional procedures such as footprinting. This assay has also been applied to a library of cationic heteroaromatic compounds based on benzimidazole, benzothiazole, carboline and azolodiazines heterocycles, with potential intercalative properties, that were synthesized by our group. For these ligands, gel intercalation assays where performed as well before the determination of their general DNA preference (AT versus GC).
- español
