Resumen de Estrategias de inmovilización de anticuerpos para la detección directa de hormonas mediante Inmunosensores de Resonancia de Plasmón Superficial
Elena De Juan Franco
En este trabajo de tesis se han desarrollado distintas estrategias para la inmovilización controlada de anticuerpos sobre la superficie sensora de dispositivos biosensores de Resonancia de Plasmón Superficial. Estos inmunosensores se han aplicado en la determinación de las hormonas hTSH y hGH, ambas de vital importancia en el desarrollo y crecimiento del individuo. El objetivo principal ha sido maximizar la eficiencia del proceso de inmovilización del anticuerpo, controlando la orientación y densidad del mismo sobre la superficie, para obtener un inmunosensor de alto rendimiento. El contenido de esta tesis se ha dividido en tres bloques distintos. En el primero de ellos se ha descrito el desarrollo de un método que presenta un gran potencial en el control de dopaje con hGHr, que es idéntica a la isoforma de la hGH de 22kDa, fracción de la hormona biológicamente activa. La relación entre los niveles de esta y de la isoforma de 20kDa es indicadora de la presencia de hGHr. Haciendo uso del sistema biotina/estreptavina para la inmovilización del anticuerpo se ha desarrollado un inmunoensayo para la detección simultánea de ambas isoformas, uno de los grandes retos en el desarrollo de tests antidoping, que por el momento requieren dos ensayos independientes. La segunda sección del trabajo se ha centrado en el desarrollo de un método novedoso para la inmovilización de anticuerpos, basado en el uso de una proteína de fusión. Se ha utilizado el par BSA/antiBSA como sistema modelo para optimizar las condiciones del método, y finalmente, este se ha empleado en un inmunoensayo para la determinación de la hGH de 22 kDa. Se ha demostrado la utilidad de la proteína para conseguir llevar a cabo una inmovilización orientada del anticuerpo, de una manera muy sencilla, y reduciendo al máximo el uso de material y tiempo empleado durante el inmunoensayo. Finalmente, en el tercer bloque se ha desarrollado un inmunosensor para el diagnóstico del Hipotiroidismo Congénito Neonatal (HCN). Se han explorado dos vías distintas en la funcionalización de la superficie sensora, una de ellas basada en la optimización de la metodología empleada en el desarrollo del inmunoensayo para la detección de las isoformas de la hGH. Como segunda estrategia se ha desarrollado un método inmovilización basado en el uso de la proteína G. Los inmunosensores desarrollados han permitido la detección en suero de niveles de 1,2 ng/mL en el caso de la hTSH, valor por debajo del nivel de corte para el diagnóstico de HCN, y de 0,9 ng/mL en el caso de la hGH de 22 y 20 kDa, valor inferior a los niveles basales de hGH 22K (~ 1,1 ng/mL) y superior a los de la hGH 20K (~ 0,11 ng/mL). Estos resultados indican que el inmunosensor desarrollado para la detección de hTSH tendría utilidad en el diagnóstico de HCN. Respecto al inmunosensor desarrollado para la detección de las isoformas de la hGH, aunque la aplicación del mismo en el análisis anti-doping estaría limitada por la reducción que experimenten los niveles circulantes de la hGH 20K tras la administración de la hormona (por un mecanismo de control por retroalimentación negativa), el inmunoensayo permite calcular la relación hGH 22K:hGH 20K, parámetro indicador de dopaje con hGHr.
