Estudios estructurales de relaxasas involucradas en el proceso de conjugación bacteriana

• Autores: Silvia Russi Delfraro
• Directores de la Tesis: Xavier Daura i Ribera (dir. tes.), Miquel Coll Capella (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Espinosa Padrón (presid.), Josep Vendrell Roca (secret.), Núria Verdaguer Massana (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DDD
• Resumen

  • La conjugación bacteriana es uno de los mecanismos de transferencia horizontal genética más importante y la causa principal de la rápida adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias. La capacidad de las bacterias para conjugarse fue descubierta en 1946 en cultivos de E. coli y, años más tarde, en bacterias Gram-positivas. El proceso de conjugación comienza con el corte de un enlace fosfo-diester específico por medio de una relaxasa que juega un papel clave en la iniciación de dicha transferencia.En el plásmido R388 de E. coli, TrwC es la transferasa que cataliza la etapa inicial y final de la transferencia conjugativa del ADN. La estructura cristalina del dominio N-terminal de la relaxasa TrwC en complejo con un oligonucleótico de 27 bases que contiene la horquilla de reconocimiento y el enlace fosfo-diester a cortar ha sido determinada por difracción de rayos X. Asimismo, se han resuelto las estructuras de una serie de complejos ternarios proteína-ADN-metal con diferentes cationes divalentes ocupando el sitio activo. Un análisis sistemático, mediante difracción anómala, permitió determinar sin ambigüedad la naturaleza del metal localizado en el sitio activo, encontrándose que Zn2+, Ni2+ y Cu2+ se unían a la tríada de histidinas. La comparación de las estructuras de los diferentes complejos sugiere la existencia de dos caminos que permiten la salida de la cadena de ADN del centro activo y que probablemente son utilizados en diferentes etapas de la reacción de proceso de conjugación. La información estructural permitió proponer (i) un mecanismo enzimático en el que el ión metálico polariza el enlace fosfo-diester a cortar facilitando el ataque por parte de la tirosina catalítica, y (ii) la serie de eventos que ocurren durante el procesamiento del ADN a transferir y que explican la función biológica de la relaxasa.Asimismo se ha estudiado y caracterizado por difracción de rayos X el dominio N-terminal de la relaxasa MobM del plásmido pMV158 de Streptococcus agalactiae en complejo con un oligonucleótido de 26 bases que mimetiza la secuencia del oriT justo hasta el sitio de corte (nic). El plegamiento global de la proteína muestra un núcleo central formado por cinco hebras betas anti-paralelas flanqueadas por dos pares de hélices alfa. Este plegamiento es estructuralmente homólogo al observado en la relaxasas de bacterias Gram-negativas, pese a la baja homología de secuencia existente entre dichas proteínas. La cadena de ADN se une a MobM mediante numerosas interacciones electrostáticas alojándose a lo largo de la amplia cavidad que la superficie de la proteína presenta. Los contactos intermoleculares se agrupan en cuatro regiones; los dos más importantes involucran dos giros betas consecutivos de la cadena proteica que penetra en el surco menor del ADN y un largo lazo flexible que rodea el extremo de simple cadena del ADN.