Resumen de Regeneración clonal de alcornoques adultos ("Quercus suber" L.) mediante embriogénesis somática
- español
El alcornoque (Quercus suber L.) es una de las especies arbóreas mediterráneas más importantes, que se extiende por el litoral mediterráneo occidental. España posee la mayor superficie de alcornocal después de Portugal, encontrándose las mayores extensiones en Andalucía, Extremadura y Cataluña. El corcho es el principal producto de esta especie y su uso más importante radica en la producción de tapones para la industria del vino. El alcornoque, además de valor económico, posee un gran valor social y ecológico en España, formando parte de las dehesas, sistemas silvopastorales de gran importancia para el desarrollo rural de las zonas donde se encuentra. El alcornoque está considerado como una especie recalcitrante tanto en sistemas de conservación de sus semillas como en su capacidad morfogénica. Actualmente está seriamente amenazado debido a diversas causas, por lo que es necesario desarrollar técnicas de propagación vegetativa eficaces que permitan la conservación de los recursos genéticos y la mejora de la especie. La embriogénesis somática está ampliamente considerada como la mejor modalidad de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales, que se utiliza en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática utilizada como vía para la regeneración clonal de alcornoques adultos. La memoria de tesis se ha dividido en varios capítulos, que se corresponden con las sucesivas fases del proceso: inducción de la embriogénesis somática, multiplicación mediante embriogénesis secundaria que da lugar a un proceso recurrente, y conversión de los embriones en planta, estudiándose el comportamiento en campo de las plantas regeneradas. Además se ha evaluado la aplicación de marcadores de ADN tipo AFLP para la determinación de la uniformidad genética de los parentales. La inducción de la embriogénesis somática se realizó en hojas en expansión, obtenidas a partir de brotes epicórmicos de ramas tomadas de alcornoques adultos. El protocolo utilizado se basó en la aplicación de los reguladores de crecimiento ácido 1-naftalenacético (ANA) y 6-bencilaminopurina (BAP), en una primera fase a concentraciones altas, en una segunda fase a concentración reducida, y en una tercera fase en medio sin reguladores. Los primeros embriones somáticos aparentemente aparecen directamente sobre el tejido, formando enseguida proliferaciones embriogénicas por embriogénesis secundaria, sin pérdida de esta capacidad proliferativa con el tiempo, siendo su potencial multiplicativo muy alto. Los cultivos embriogénicos se fraccionaron y transfirieron mensualmente a medio de cultivo fresco. A continuación se procedió a la conversión de los embriones somáticos, lo que supuso la maduración y la germinación adecuadas de los mismos, y la transferencia a condiciones ex vitro de las plantas somáticas para su aclimatación. Se ha comprobado que la presencia conjunta de ANA y BAP, su concentración y el tiempo de exposición determinan la respuesta embriogénica, siendo las más efectivas 50 ?M de ANA y 10 ?M de BAP aplicadas durante 30 días en la primera fase. Además se sugiere la existencia de una ventana en el desarrollo de la hoja más sensible a la inducción, pues las hojas mayores de 15 mm perdieron la capacidad embriogénica, equivalente a lo establecido para la inducción de embriogénesis somática en embrión cigótico de alcornoque. Se ha determinado que tanto el genotipo como el momento de recolección y su interacción, influyen en la respuesta embriogénica. Se ha constatado que existe control genético sobre la inducción de embriogénesis: la heredabilidad en sentido estricto de la capacidad de las hojas para dar embriogénesis somática, h2i =0,41, indica cierto grado de control genético aditivo sobre este carácter. Sin embargo no se han observado diferencias entre procedencias geográficas en relacion a esta capacidad, siendo más importantes las capacidades individuales. Se ha verificado que es posible la conservación en frío de los cultivos embriogénicos durante cuatro meses, lo que permite reducir los gastos de mantenimiento asociados a las transferencias frecuentes. El genotipo también influyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos. La germinación de los embriones somáticos no se vió afectada por la madurez de los embriones en términos de tamaño y peso fresco, pero sí la supervivencia de las plantas generadas a partir de éstos. Se ha establecido una parcela de ensayo con plantas somáticas procedentes de alcornoques sobresalientes y de sus progenies de medio-hermanos, que permite estudiar su comportamiento y su comparación con plantas cigóticas. La supervivencia y los crecimientos iniciales de las plantas de origen cigótico fueron superiores a las de origen somático, lo que estaría relacionado con las mayores reservas del embrión cigótico. Las plantas somáticas de origen adulto crecieron más que las de origen juvenil e igualaron pronto a las de origen cigótico, mostrando el valor genético de los árboles sobresalientes transferido a su progenie vegetativa. Con este trabajo se confirma la validez del proceso embriogénico para la propagación vegetativa de alcornoques adultos, habíéndose obtenido plantas de todos los árboles selectos en los que se ha acometido su clonación, incluido un alcornoque singular de la isla de Menorca en riesgo de extinción, como ejemplo de conservación de recursos genéticos. Los marcadores AFLP muestran una gran sensibilidad para revelar diferencias, pero algunas de ellas cabe achacarlas a inconsistencias de la técnica. Estas inconsistencias, que llegaron al 3,8% de polimorfismo, estuvieron relacionadas con el genotipo. Cuando se analizaron hojas tomadas de diferentes posiciones dentro de siete árboles, todos estuvieron por debajo de este nivel o igualados al mismo, excepto uno que alcanzó el 7,1% de polimorfismo. Ello hace necesario determinar el posible nivel de variación preexistente en el material a clonar, antes de acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal.
- English
The cork oak (Quercus suber L.) is one of the most important Mediterranean forest tree species. The cork oak spreads over the western and coastal region of the Mediterranean area, under an Atlantic influence, occupying the biggest areas in Portugal and Spain. Andalusia, Extremadura and Catalonia have the largest cork oak forests in Spain. Cork oak’s main product is cork, which can be stripped from the tree without severe damage at regular intervals. Hence it is a renewable raw material for the production of stoppers in wine industry, the main use at present. This production determines the management of the cork oak stands. Besides its economic value, the cork oak tree has also an important social and ecological value to Spain, being part of “dehesas”, which are forest and grazing land systems of great importance for rural development. Nowadays, cork oak stands are endangered because of several causes like forest fire, excessive grazing, replacement by crops, low natural regeneration, losses by cork oak decay (“seca”) and commercial competition with cork substitutes. The cork oak tree is a recalcitrant species for seed conservation and morphogenic ability. Therefore, developing vegetative propagation technologies for conservation of genetic resources and improvement of the species are of paramount importance. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present work studies some aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature cork oak trees. This thesis is divided in several chapters, related to the consecutive phases of the process: induction of somatic embryogenesis, multiplication by recurrent embryogenesis and somatic embryo conversion. The application of AFLP markers to test the donor trees for genetic uniformity has also been studied. Expanding leaves were used as initial explants to induce somatic embryogenesis. They were excised from epicormic shoots, which were forced to flush from pieces of branches taken from the crown of mature cork oak trees. The induction of somatic embryogenesis was achieved on media supplemented with 1-naphthaleneacetic acid and 6-benzylaminopurine, first at high concentration and then on a secondary medium at lower concentration. Most somatic embryos were obtained in a third phase, on the same medium lacking plant growth regulators. Embryos seemed to arise directly on the tissue surface. Embryogenic masses were formed by secondary embryogenesis, starting a very productive recurrent process, without decline in their multiplication ability for years. The presence, concentration and exposure time to plant growth regulators influenced the embryogenic response. The best response was achieved with 50 µM NAA plus 10 µM BAP in the primary induction medium, and 30 days culture on this medium. Only expanding leaves that were less than 15 mm length gave somatic embryos. Therefore, the existence of a developmental window that could be more prone to induction, similar to the described for the induction in immature cork oak zygotic embryos, is suggested. The frequency of induction of somatic embryogenesis was also influenced by genotype, harvest time and their interaction. The genetic control on the induction process was confirmed: the narrow sense heritability of the ability of cork oak leaves to give somatic embryogenesis was h2 i =0,41, indicating some degree of additive genetic control on this trait. However no significant effect of geographical provenances was found, the individual effect being more remarkable. Cork oak embryogenic cultures could be stored at low temperature for four months without loss of their proliferative ability, which permitted to reduce the maintenance costs by increasing subculture periods. Genotype influenced the multiplication of embryogenic lines as well as the conversion of somatic embryos into plants. The degree of maturation of somatic embryos, in terms of size and fresh weight, did not influence their frequency of germination, although affected the survival of the somatic seedlings that they gave rise. A field trial with somatic seedlings from somatic embryos induced from selected cork oak trees and from their half-sib progenies, conjointly with plants from acorns of the same families, was established. Survival and initial growth were better for acorn-derived plants than for somatic seedlings, reflecting the initial advantage of the former due to their higher reserves in cotyledons. The somatic seedlings from adult trees grew better than the somatic seedlings from the half-sib progenies, and they reached the same vigour than zygotic-derived plants very soon, showing the better genetic potential of this vegetative progeny of the selected trees. The efficiency of the defined protocol to clone mature cork oak trees, was confirmed producing plants from all the selected trees, and even from a singular, endangered tree from the Minorca Island, as an example of the application of this technique for the conservation of genetic resources. AFLP markers are very sensitive to detect changes in the DNA, but caution should be taken because the technique may give some inconsistencies. Up to 3.8% polymorphisms were considered inconsistencies, and they were related to genotype. When analysing possible intraindividual variability, most of the genotypes showed percentages of polymorphism lower or equal than the considered “error” of the technique. However, up to 7.1% polymorphism was found in one tree among positions. Therefore, pre-existent variability within the donor plants cannot be discarded when performing early testing of somaclonal variation.
