Selectividad de los diferentes subtipos de canales de calcio voltaje-dependientes en la muerte celular inducida por veratridina en células cromafines bovinas

• Autores: Vanesa Ocaña Martínez
• Directores de la Tesis: Francisco Carlos Pérez Martínez (dir. tes.), Valentín Ceña Callejo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Joaquín del Río Zambrana (presid.), Inmaculada Posadas (secret.), Jose Ramon Naranjo Orovio (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RUIdeRA
• Resumen

  • Las células cromafines son un modelo muy utilizado para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la muerte neuronal. En este tipo celular, los canales de calcio voltaje-dependientes (CCVD) constituyen una de las principales vías de entrada de calcio (Ca2+) a la célula en respuesta a la despolarización de la membrana plasmática o a estímulos farmacológicos, siendo los CCVD de tipo L, N y P/Q los más abundantes en las células cromafines bovinas. En este sentido, resulta de gran importancia la búsqueda de nuevos antagonistas selectivos o moduladores de subtipos específicos de CCVD para el estudio y tratamiento en alguna de las diversas patologías en las que estos canales están involucrados. La transfección de material genético mediante nanopartículas (NPs) ha surgido como una buena alternativa para estudiar el papel que juegan los CCVD en diversas situaciones fisiológicas o patológicas. En esta Tesis Doctoral, hemos estudiado una hipótesis novedosa como es el asignar una función específica al Ca2+ que entra en las células excitables a través de un tipo específico de CCVD. Para ello, hemos utilizado un nuevo vector no-viral para internalizar RNA pequeño de interferencia (siRNA) en el interior de las células cromafines bovinas. Para dilucidar el papel específico que desempeñan los CCVD en la toxicidad inducida por veratridina (VTD), hemos silenciado de forma selectiva genes que codifican la subunidad ¿1 de los CCVD: Cav1.1, Cav1.2 y Cav1.3 (tipo L), Cav2.2 (tipo N), Cav2.1 (tipo P/Q) y Cav2.3 (tipo R), y hemos estudiado los cambios en el patrón de toxicidad de VTD en células cromafines bovinas, evaluando la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la actividad mitocondrial por ensayos de MTT, el aumento de la actividad caspasa 3 (apoptosis) y la muerte celular mediante ensayos de LDH. En células cromafines bovinas en cultivo, la exposición a VTD (100 µM) induce, a través del aumento de la concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i), la activación de varios mecanismos moleculares que conducen a la muerte celular. En este sentido, nuestros resultados confirman que hay una relación directa entre la cantidad de Ca2+ que entra en las células mediante un determinado tipo de CCVD y el papel que desempeña en los procesos patológicos inducidos por VTD. La reducción de los niveles de RNA mensajero (RNAm) codificados por los genes Cav2.2 (CCVD tipo N) y Cav2.1 (CCVD tipo P/Q) mediante un vector no-viral (TRANSGEDEN®) parece inhibir de forma significativa la entrada de Ca2+ al interior celular, la producción de ROS, el deterioro bioquímico mitocondrial y la actividad caspasa 3, mostrando ser los que desempeñan un papel más relevante en la toxicidad inducida por VTD. Además, el silenciamiento de ambos genes de forma simultánea, reduce marcadamente la toxicidad producida por VTD. Por otro lado, los canales Cav1.2 y Cav1.3 (CCVD tipo L) muestran un papel menos relevante en la activación de la muerte celular inducida por VTD ya que, aunque su ausencia inhibió ciertos efectos tóxicos inducidos por VTD, no produjo cambios significativos en la muerte de las células cromafines bovinas.