Producció recombinant de la gonadotrofina coriònica equina amb el llevat Pichia pastoris

• Autores: Anna Ubach Font
• Directores de la Tesis: Pau Ferrer Alegre (dir. tes.), Francisco Valero Barranco (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ricardo de la Fuente López (presid.), Gloria González (secret.), Alicia Serrano (voc.)
• Programa de doctorado: Biotecnologia
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Hormonas
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • En aquest estudi es presenta el procés d'obtenció d'una proteïna recombinant, l'hormona gonadotrofina coriònica equina (eCG) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris.S'ha sintetitzat els gens mitjançant la tècnica de PCR, ja que les seqüències són relativament curtes, 294 i 472 nucleòtids pels gens codificadors de la cadena α i β, respectivament. Això ha permès poder modificar la seqüència per tal d'adaptar-la a l'ús codons més utilitzats per P. pastoris, eliminar i afegir dianes de restricció per facilitar el clonatge, eliminar la seqüència senyal pròpia i treure els introns que conté la seqüència genòmica de la cadena β.D'acord amb la seqüència de DNA optimitzada obtinguda s'han dissenyat una sèrie d'oligonucleòtids amb una petita part de seqüència solapada que serviran per la síntesi de cada un dels dos gens. La tècnica de PCR ha permès la fusió d'aquests oligonucleòtids per obtenir els dos gens, els quals s'han clonat al plasmidi d'expressió pPICZα sota el control del promotor AOX.A partir dels plasmidis que contenen només un dels dos gens s'han obtingut dues construccions que contenen els dos cassets d'expressió en els dos ordres possibles: pPICZα-eCGα+β i pPICZα-eCGβ+α.S'han obtingut cinc transformants amb cada construcció, se n'ha avaluat la seva capacitat productiva amb cultius en erlenmeyer i una transferència de punts. S'han fet cultius en discontinu i en discontinu alimentat per produir suficient hormona per poder desenvolupar un procés de purificació i poder caracteritzar parcialment l'hormona recombinant. La cua de 6 histidines present en la cadena α hauria de permetre fer una purificació en un sol pas amb una cromatografia d'afinitat amb metalls quelants, però no ha estat així; la proteïna era incapaç d'unir-se a la resina i per tan, no s'ha pogut separar de la resta de proteïnes del brou mitjançant aquesta tècnica.Per això s'ha plantejat un procés de purificació més complex, tot i que s'ha procurat minimitzar-ne el nombre d'etapes. La concentració inicial del brou obtingut permet treballar amb volums més reduïts. Segueix una diafiltració que permet disminuir l'alt contingut en sals del brou de cultiu i tenir la proteïna en un tampó estàndard. D'aquesta manera també s'han eliminat les proteïnes de pes molecular més petit de 10 kDa.Segueixen dues etapes de cromatografia, la primera de bescanvi iònic i la segona ha estat de sedàs molecular. Amb aquest procés s'ha aconseguit un producte final suficientment pur, tot i que alguns dels resultats de la caracterització apunten que encara hi pot haver quedat alguna proteïna no desitjada de propietats físico-químiques molt semblants a la eCG.S'ha caracteritzat, breument, l'hormona recombinant parcialment purificada, comparant-la amb l'hormona nativa. S'ha determinat el pes molecular, el punt isoelèctric i el grau de glicosilació.Amb una preparació de eCG recombinant en solució salina s'han fet les proves d'activitat in vitro, que han donat positives i d'activitat in vivo, que han donat negatives.Així doncs, podem dir que s'ha aconseguit produir l'hormona eCG amb el llevat P. pastoris, tot i que falta perfeccionar el procés de purificació per a obtenir-la en quantitat i qualitat adequada.