Resumen de Regulación de TrkA a través del dominio intracelular: efecto de la unión a calmodulina y de la tirosina 701
Yolanda de Pablo Llavall
- español
TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosina kinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès en descobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixement nerviós (NGF).
Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand al receptor i que donen lloc a lactivació de les vies de senyalització de les MAPK y PI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transport retrògrad també juguen un paper important per a lefecte a llarg termini del NGF i que és un tret distintiu en relació a daltres receptors de factors de creixement.
Lactivació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+ intracel· lular. Per això ens vam plantejar lestudi de la relació entre lactivació de TrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.
En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM i la meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball se centra en caracteritzar aquesta interacció.
Per veure lefecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquests no impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten la proteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasa constitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitals per a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc dunió a CaM de TrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.
Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització duna regió que conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part dun motiu dinternalització. Lúltima part del treball se centra en descriure les característiques daquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituir una fosforilació inhibitòria per lactivitat de Trk i un lloc de regulació negativa de la internalització.
RESUMEN TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosina kinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés tras descubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGF).
Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando al receptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK y PI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporte retrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo del NGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores de crecimiento.
La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+ intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación de TrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.
En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaM y la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajo se centra en caracterizar esta interacción.
Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos no impiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisis del receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.
Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, el segundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para así poder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.
Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de una región que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de un motivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir las características de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM, puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar de regulación negativa de su internalización.
- English
TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinase domain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nerve growth factor (NGF).
The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And also the pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptor internalization and retrograde transport are also important for the long term signaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors among other growth factor receptors.
Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.
Thats why we thought on studying the relationship between TrkA activation and calmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.
First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM and the c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on the characterization of this interaction.
In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.
NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trk was cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous and necessary for many cell processes, so the second objective has been to search for the CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective in CaM binding.
We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutes a trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this project deals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless of CaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the region constitutes a negative regulator of internalization.
