Participació dels receptors muscarínics presinàptics (mAChRs) en l'eliminació de les connexions sinàptiques redundants durant el desenvolupament neuromuscular

• Autores: Maria Isabel Salón Cabré
• Directores de la Tesis: Manuel Santafé Martínez (dir. tes.), Josep Maria Tomàs Ferré (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Rovira i Virgili ( España ) en 2005
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jose Maria Domenech Mateu (presid.), Ma. Angel Lanuza Escolano (secret.), Nicolau Ortiz Castellon (voc.), Marcelo Rosato Siri (voc.), Anna Gumà Garcia (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen

  • Antecedents Durant els primers dies del desenvolupament postnatal les plaques motores es troben multiinnervades fins amb 5 axons. Aquesta multiinnervació decreix progressivament fins a ladultesa on les plaques motores es troben innervades per un sol axó. En aquesta pèrdua axonal o eliminació sinàptica es troben implicats una sèrie de mecanismes presinàptics i postsinàptics relacionats amb el nivell dactivitat neuromuscular. En aquest context, poden estar implicats els autoreceptors muscarínics (mAChRs). En les sinapsis neuromusculars colinèrgiques existeixen autoreceptors muscarínics axonals sensibles al neurotransmissor que ell mateixos alliberen.

    Objectius Sestudia la participació dels diferents tipus de mAChRs en el procés deliminació sinàptica en la sinapsi neuromuscular de rata nounat mitjançant tècniques electrofisiològiques de registre intracel·lular convencional. També es vol determinar amb precisió els tipus de mAChRs presents en la sinapsi neuromuscular de la rata adulta, la seva relació amb els canals de calci dependents de voltatge (VDCC) i els mecanismes intraaxonals implicats.

    Metodologia Sutilitza com a model les sinapsis neuromusculars del múscul Levator Auris Longus de rates adultes i nounats. Mitjançant el registre intracel·lular estudiem com diferents antagonistes muscarínics afecten els potencials de placa evocats (EPP) de la sinapsi neuromuscular adulta i de la sinapsi monoinnervada i doblement innervada de lanimal nounat. Per estudiar la possible relació dels muscarínics amb els VDCC incubem, prèviament, el múscul mitjançant blocadors dels canals de calci (Nitrendipina, ?-Conotoxina-GVIA i ?-Agatoxina-IVA) abans de determinar la resposta muscarínica.

    Per identificar una sinapsi doblement innervada en els animals nounats observem si a mesura que augmentem la intensitat de lestímul elèctric apareix un segon EPP després del primer. Seguidament, les amplades dels potencials de placa més baixes i més altes es designen com a EPP petit i EPP gran, respectivament.

    Principals resultats En ladult, lantagonista selectiu pel receptor muscarínic M1, Pirenzepina redueix la neurotransmissió evocada. Per altra banda, lantagonista selectiu pel receptor muscarínic M2, Metoctramina incrementa lalliberació evocada del neurotransmissor. Aquests dos mecanismes mediats pels muscarínics M1 i M2 depenen de lentrada de calci per mitjà del canal P/Q. No trobem cap dada que ens indiqui la presència dels receptors muscarínics M3 (sensibles a 4-DAMP) i els receptors muscarínics M4 (sensibles a Tropicamida) en els músculs danimals adults.

    En el nadó, la resposta dels agents muscarínics en el terminal nerviós de les sinapsis monoinnervades és similar a la resposta de lEPP gran en les sinapsis doblement innervades. Aquestes respostes impliquen una inhibició de lalliberació de lACh per mitjà de lantagonista del receptor muscarínic M1, Pirenzepina i per mitjà de lantagonista del receptor muscarínic M2, Metoctramina. LEPP petit és també inhibit per lantagonista del receptor muscarínic M2, Metoctramina però, és augmentat per lantagonista del receptor M1, Pirenzepina i lantagonista del receptor M4, Tropicamida.

    En relació als canals de calci dependents de voltatge, observem un canvi gradual des de la implicació dels VDCC tipus P/Q, N i L en totes les respostes mediades pels muscarínics M1, M2 i M4 en lEPP petit, fins a la implicació dun únic canal, el P/Q, en les respostes dels receptors M1 i M2 en les plaques monoinnervades. Aquest fet indica lexistència dun progressiu tancament dels VDCC paral·lel a lespecialització del canal tipus P/Q de ladult.

    Conclusió principal Els autoreceptors muscarínics poden, globalment, potenciar el terminal que genera lEPP gran i inhibir el terminal que genera lEPP petit col·laborant així en leliminació sinàptica del desenvolupament.

    SUMMARY Title Participation of presinaptic muscarinic receptors (mAChRs) in redundant synaptic connections elimination during neuromuscular development.

    Antecedents During first postnatal developing days the motor endplates are multiinnervated, this multiinnervation decrease at the next weeks until the adult age, when the motor endplates are monoinnervated. Is in this axonal losing or synaptic elimination where there are implicated presynaptic and postsynaptic mechanisms related with neuromuscular activity levels. In this context, muscarinic autoreceptors (mAChRs) can be involved.

    In the cholinergic neuromuscular junctions there are presynaptic muscarinic autoreceptors(mAChRs) with sensibility to neurotransmitter released by themselves.

    Objectives In this work we investigate the participation of different subtypes of mAChRs in the synaptic elimination period in the newborn rat neuromuscular junction with electrophysiological recording techniques. We want previously determining, the presence of different subtypes, the functional behaviour and the voltage dependent calcium channels (VDCC)-dependence of the mAChRs in the adult motor nerve terminals.

    Methods We investigate presynaptic muscarinic autoreceptors involved in the modulation of neurotransmitter release and their VDCC-dependence, in the Levator Auris Longus muscle neuromuscular junction of newborn and adult rats. We use intracellular recording techniques to study who different muscarinic antagonists affect the endplate potentials (EPP) in the adult and newborn neuromuscular junctions.

    We previously incubated the muscle with VDCC blockers (Nitrendipine, ?-Conotoxin- GVIA, ?-Agatoxin-IVA) before determining the muscarinic response, to study the possible relation to mAChRs with VDCC.

    Results In the adult, the M1 antagonist Pirenzepine (10 µM) decreases the evoked release. On the other hand, the M2 antagonist Methoctramine (1 µM) increases the evoked neurotransmitter release. Both mechanisms, depends on the calcium influx from the external media via P/Q calcium channels. We found no indices of M3 (4-DAMP-sensitive) or M4 (Tropicamide-sensitive) muscarinic receptors in the adult animals muscles.

    In the newborn, in dually innervated fibers, a second EPP can appear after the first when the intensity of the electrical stimulus is raised. The lowest and highest EPP amplitudes are designed as the small- EPP and the large- EPP, respectively.

    The muscarinic agents response in the nerve terminal of monoinnervated synapses is similar to the large EPP response in dually innervated junctions. This response involved an ACh release inhibition by M1 muscarinic antagonist Pirenzepine and by M2 muscarinic antagonist Methoctramine. However, M1 antagonist Pirenzepine and M4 antagonist Tropicamide increase the small EPP.

    In relation to VDCC-dependence we observe a gradual change in the small EPP, from the P/Q, N, and L VDCC implication in all responses where the M1, M2 and M4 muscarinics are involved, to the implication of a lonely channel, the P/Q, in the M1 and M2 responses in the monoinnervated endplates.

    This indicates the existence of a progressive shutoff in parallel with maturation and specialization of the adult type P/Q channel.

    Main conclusion In summary, muscarinic autoreceptors can directly modulate both, large-EPP generating ending potentiation, and small-EPP generating ending depression by their association with VDCC in developing neuromuscular junction.