Caracterització del gen Acetoacetil-CoA sintetasa
- Autores: Francesca M. Aguiló Payeras
- Directores de la Tesis: Diego Haro Bautista (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2008
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Zorzano Olarte (presid.), Joan Carles Rodríguez Rubio (secret.), Anna Messeguer Navarro (voc.), Ana María Proenza Arenas (voc.), Marta Giralt i Oms (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
CATALÀ: La cetogènesi és un procés mitocondrial a partir del qual es sintetitzen els cossos cetònics: acetona, acetoacetat i 3-hidroxibutirat, que són emprats com a font d'energia en el mitocondri dels teixits extrahepàtics a través de l'acció de la Succinil-CoA:3-cetoàcid-CoA transferasa (SCOT). Alternativament, en el citosol dels teixits lipogènics, l'acetoacetat pot ser activat a acetoacetil-CoA, a través de l'enzim Acetoacetil-CoA sintetasa (AACS), proporcionant unitats acetil-CoA de manera independent i anàloga al citrat produït en el mitocondri, transferit al citosol i escindit per l'ATP-citrat liasa.1. Estudi de la funcionalitat de la seqüència del cDNA del gen AACS humà predit. Hem demostrat que la seqüència predita del cDNA del gen AACS humà codifica per una proteïna funcional. Els valors de les constants de Michaellis-Menten (Km) de la proteïna GST-AACS son de 37.6M, 155.24M i 2.3M per l'acetoacetat, l'ATP i el CoA, respectivament. A més, l'enzim AACS humà és inhibit a 15 M de CoA. 2. Estudi de les modificacions posttraduccionals de la proteïna AACS humana.L'anàlisi de la seqüència aminoacídica de la proteïna AACS humana revela la presència de diversos residus de lisina com a putatius llocs d'acetilació. La substitució de la Lys634 per Arg provoca una disminució de l'estat d'acetilació de la proteïna però no l'aboleix totalment. Mitjançant la deleció de l'extrem COOH-terminal hem pogut concloure que aquesta regió és determinant per a l'estat d'acetilació, encara que no es pot descartar la possibilitat d'altres residus de lisina acetilables en l'extrem NH2-terminal.3. Aportació al procés de la colesterogènesi del gen AACS humà.S'ha analitzat l'efecte de la sobreexpressió de la proteïna AACS humana en el procés de la colesterogènesi, mitjançant la generació d'un sistema induïble BDTMTet-On Gene Expression system en cèl·lules HeLa. L'acetoacetil-CoA, fruit de la reacció catalitzada per l'AACS, és incorporat de manera preferencial cap a la síntesi de colesterol, implicant que l'esquelet de quatre carbonis de l'acetoacetat o bé la seva forma activa, l'acetoacetil-CoA, no s'equilibra completament amb el pool de dos carbonis representat per l'acetat i l'acetil-CoA. Una de les hipòtesis que explicarien aquest fet és la possible existència d'interaccions (channeling) entre els primers enzims de la via de la colesterogènesi, és a dir, entre l'AACS i l'HMGCS1. No obstant això, els nostres experiments mostren que ambdues proteïnes no interaccionen ni de manera directa ni indirecta.4. Estudi dels mecanismes de regulació transcripcional del gen AACS humà.Hem caracteritzat els elements necessaris per a que es produeixi l'activitat basal del gen AACS humà i hem estudiar la seva regulació transcripcional per factors de transcripció implicats en l'homeòstasi lipídica: LXR, SREBPs i PPAR. Els nostres resultats mostren que l'Inr és funcional, i que les caixes GC presents en el promotor proximal del gen AACS uneixen el factor de transcripció Sp1, important en la mediació de l'activitat basal d'aquest promotor. Els putatius LXRE i SRE, localitzants en el promotor in silico, no són funcionals. En canvi, PPARregula l'expressió del gen AACS d'una manera no canònica a través de la proteïna Sp1 i mitjançant la interacció amb les caixes GC. 5. Regulació de l'expressió del gen AACS de rata en diferents situacions fisiològiques: ritme circadiari.L'expressió del gen AACS està sotmesa a regulació circadiària, produint-se el zenit d'expressió en fetge i en TAB a l'inici de la fase fosca, coincidint amb el període de màxima activitat dels rosegadors. El patró d'expressió del factor de transcripció SREBP-1 i de l'AACS en fetge és paral·lel, suggerint que SREBP-1c podria ser responsable de mitjançar la regulació de l'expressió de l'AACS en aquest òrgan en les situacions fisiològiques estudiades: dejuni/realimentació en les fases diürna i nocturna, i administració d'insulina.
