Eliminación de la actividad silanofílica en cromatografía líquida en fase inversa mediante el uso de aditivos
- Autores: Juan José Fernández Navarro
- Directores de la Tesis: Maria Jose Ruiz Angel (dir. tes.), Mª Celia García Alvarez-Coque (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan J. Baeza Baeza (presid.), Monica Catala Icardo (secret.), Clara Ràfols Llach (voc.)
- Calificación: Apto Cum Laude
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: RODERIC
- Resumen
La gran mayoría de los compuestos utilizados como principios activos en los productos farmacéuticos contienen átomos de nitrógeno básicos en su estructura. Su análisis por cromatografía líquida de fase inversa (reversed-phase liquid chromatography, RPLC) con columnas de sílice presenta una serie de inconvenientes, entre los que destacan retenciones elevadas, picos con colas y bajas eficacias, lo que se debe a la presencia de grupos silanoles residuales en la fase estacionaria que cuando están ionizados, interaccionan con los analitos catiónicos a través de un proceso de intercambio iónico, siendo el efecto más o menos pronunciado dependiendo de la columna seleccionada. Aunque aparentemente muchos materiales son similares, existen diferencias en sus prestaciones en función del tipo de sílice en la columna y el grado de empaquetamiento. En la actualidad, con la comercialización de columnas de nueva generación, junto con la mejora de la tecnología empleada en los empaquetamientos de RPLC, la influencia de los silanoles residuales sobre el comportamiento cromatográfico de los compuestos básicos es menos acusada. Sin embargo, el problema no se ha eliminado por completo. Una práctica muy eficaz para enmascarar el efecto de los silanoles es la adición de compuestos a la fase móvil, que son adsorbidos sobre la fase estacionaria modificando sus propiedades. Experimentalmente, la metodología es sencilla de aplicar, ya que no requiere el uso de equipamiento o columnas con características especiales, sino que basta con añadir a la fase móvil hidro-orgánica (habitualmente tamponada a un pH ácido) una pequeña cantidad del agente enmascarante seleccionado. Entre los aditivos empleados, recientemente han destacado los líquidos iónicos y los surfactantes. Aunque se ha publicado una amplia bibliografía en la que se trata el tema de la mejora de la separación cromatográfica de compuestos básicos, al inicio de esta Tesis no existían conclusiones claras acerca de qué directrices debían considerarse para elegir el aditivo más adecuado en cada caso concreto. Por otra parte, no siempre que se proponen nuevos aditivos o se aplican los habituales a nuevas familias de analitos, se profundiza en el estudio de los mecanismos de retención que tienen lugar, o se efectúan comparaciones respecto a los resultados obtenidos con otros tipos de aditivos o aplicando otras soluciones, como el uso de fases estacionarias especialmente diseñadas para el análisis de compuestos básicos. Ello da lugar a que, entre las opciones existentes, no siempre se elija la más adecuada. Éste ha sido precisamente el objetivo principal que se ha pretendido desarrollar a lo largo de esta Tesis Doctoral. Así, se ha estudiado el comportamiento cromatográfico de dos familias de compuestos básicos (?-bloqueantes y antidepresivos tricíclicos), utilizando fases móviles que contienen líquidos iónicos o surfactantes. Los inconvenientes asociados a la elución de estos analitos en RPLC, en ausencia de aditivo, son resueltos satisfactoriamente en la mayoría de los casos, y se apuntan directrices a seguir respecto a la fase estacionaria y aditivo más adecuados para cada caso concreto. El resultado más destacable es que la adición a la fase móvil de un líquido iónico adecuado permite que una columna cromatográfica de bajo precio proporcione resultados comparables o ventajosos respecto a los obtenidos con columnas especiales de alto precio. La Memoria de Tesis incluye también estudios en la línea del compromiso por el desarrollo de una Química Analítica verde y sostenible, que se concreta en la posibilidad de utilizar fases móviles formadas por agua y jabón con el surfactante neutro Brij-35. Particularmente interesantes son los resultados obtenidos con un grupo de flavonoides, cromatografiados a alta temperatura. Todos estos aspectos se recogen en la Memoria de Tesis a lo largo de cinco capítulos, divididos en dos partes que se detallan a continuación: La primera parte consta de tres capítulos, en los que se exponen estudios fundamentales sobre la interacción de cuatro líquidos iónicos con columnas de RPLC y la modificación del comportamiento cromatográfico de compuestos básicos. Concretamente, se describe un estudio exhaustivo del mecanismo de retención que posiblemente tiene lugar en la elución cromatográfica de ?-bloqueantes, utilizando una columna Kromasil C18, en presencia de diversos líquidos iónicos que contienen en su estructura un catión imidazolio con una cadena alquílica de longitud variable, y los aniones tetrafluoroborato o hexafluorofosfato. El comportamiento observado en presencia de los líquidos iónicos se compara con el del surfactante aniónico dodecilsulfato sódico y trietilamina. Tras establecer que los líquidos iónicos asociados al anión tetrafluoroborato son más efectivos como enmascarantes de los grupos silanol, se amplía el estudio de sus prestaciones a diversas columnas C18 con contenidos diversos de silanoles libres. La potencia supresora del aditivo sobre el efecto de los silanoles se establece en base a la disminución de la retención y a la mejora de la forma de los picos cromatográficos. Normalmente, los estudios que hacen uso de líquidos iónicos examinan un número reducido de fases móviles de distinta composición, en las que la concentración del disolvente orgánico seleccionado se mantiene generalmente fija, lo que limita la obtención de información acerca del comportamiento cromatográfico de los analitos en un amplio intervalo de condiciones. Por este motivo, se aplica una estrategia de optimización interpretativa, para encontrar las condiciones de separación óptimas para un grupo de ?-bloqueantes eluidos con fases móviles que contienen concentraciones variables de acetonitrilo y del líquido iónico tetrafluoroborato de 1-hexil-3-metilimidazolio, utilizando tres columnas C18 de distinta naturaleza. Se comprueba así la superioridad de este líquido iónico en el análisis de compuestos básicos. La segunda parte de la Memoria de Tesis consta de dos capítulos que abordan la utilidad del surfactante Brij-35 en la separación de compuestos básicos y flavonoides, cuando se utiliza en condiciones micelares como aditivo en RPLC. El Brij-35 es un surfactante de uso minoritario en la técnica denominada “cromatografía líquida micelar”, pero con perspectivas interesantes de cara a la “Química verde”. En primer lugar, se desarrolla un procedimiento para la determinación de un grupo de antidepresivos tricíclicos en preparados farmacéuticos que no utiliza disolvente orgánico. Se estudia, también, el efecto de la temperatura sobre la retención y la forma de pico para un grupo de flavonoides. Estos compuestos muestran una interesante interacción con Brij-35, con una cinética de reparto particular para cada flavonoide, en función de la posición de los grupos oxhidrilo en los anillos de su estructura. A temperatura ambiente, el Brij-35 origina picos cromatográficos anchos y baja resolución, debido a la lentitud del equilibrio de adsorción-desorción sobre fases estacionarias de RPLC recubiertas con este surfactante. Al aumentar la temperatura, se incrementa la velocidad de este equilibrio, asemejándose el comportamiento de los flavonoides al observado con fases móviles de acetonitrilo-agua, para las que la cinética de reparto alcanza rápidamente la condición de equilibrio. En definitiva, el conjunto de trabajos presentados en esta Memoria pretende ser una contribución al reconocimiento de la práctica del uso de aditivos en las fases móviles en RPLC, para mejorar la separación de compuestos básicos y fenólicos, y proporcionar un criterio que permita decantarse con fiabilidad por un determinado tipo de aditivo y/o columna, según las necesidades e intereses que se persigan en un análisis particular.
