Insights into the specificity and function of M14 metallocarboxypeptidases from structural and degradomic studies

• Autores: Sebastian Martin Tanco
• Directores de la Tesis: Francesc Xavier Avilés Puigvert (dir. tes.), Julia Lorenzo Rivera (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2012
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Gunnar Pejler (presid.), Sandra Villegas Hernández (secret.), Oscar Yanes (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Química analítica
      • Espectroscopia de masas
    • Bioquímica
      • Proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  DDD  TESEO 
• Resumen

  • Las proteasas son enzimas que escinden proteínas catalizando la hidrólisis del enlace peptídico. Todas las proteínas sufren proteólisis en algún momento u otro de su ciclo de vida y de este modo las proteasas regulan casi todos los procesos biológicos. Las carboxipeptidasas son proteasas que hidrolizan el enlace C-terminal de las proteínas y péptidos. En esta tesis se estudia a las carboxipeptidasas de la familia M14 en la clasificación de MEROPS (y que describiremos como metalocarboxipeptidasas). Las metalocarboxipeptidasas controlan importantes procesos biológicos, como son la regulación de la presión sanguínea, el equilibrio entre coagulación y fibrinólisis, o el procesamiento de neuropéptidos y hormonas peptídicas. Además, están implicadas en procesos patológicos como el cáncer o las enfermedades neurodegenerativas. La información disponible sobre la función biológica de estas enzimas es muy limitada, por lo que en la presente tesis se planteó como objetivo profundizar en el estudio de la función de varias metalocarboxipeptidasas. Con esta finalidad se realizaron ensayos cinéticos, estudios de biología celular y de determinación de la estructura tridimensional. Además, se desarrollaron y aplicaron distintas técnicas proteómicas para el estudio de los sustratos de carboxipeptidasas (y que se incluyen por lo tanto dentro del campo de la degradómica). Esta tesis se compone de cuatro trabajos de investigación independientes en los que se caracteriza funcional y estructuralmente a distintas metalocarboxipeptidasas. En el primer trabajo se determinó la estructura tridimensional de una isoforma corta del gen silver de Drosophila melanogaster, correspondiente al primer dominio de la carboxipeptidasa D de mamíferos. La mutación de este gen genera moscas adultas con cutículas pálidas o plateadas y con alas puntiagudas. Esta estructura tridimensional fue obtenida en presencia del inhibidor GEMSA a una resolución de 2,7 Å y se corresponde en general con la estructura canónica de otras carboxipeptidasas de su subfamilia. Presenta sin embargo como elemento distintivo un lazo flexible fácilmente accesible a las proteasas, por lo que la proteólisis podría constituir un mecanismo de regulación de esta enzima. En el segundo trabajo se incluye la caracterización bioquímica y funcional de la carboxipeptidasa A4 humana (CPA4), la cual ha sido asociada con la agresividad del cáncer de próstata. Se determinó que esta enzima es secretada al espacio extracelular y muestra un pH óptimo neutro. Mediante aproximaciones peptidómicas se identificaron distintos péptidos bioactivos como posibles sustratos de la CPA4: la neurotensina, diversas graninas y péptidos opioides tales como la Met- o Leu- encefalina. Estos péptidos están involucrados en la proliferación y diferenciación de las células de cáncer de próstata, y permiten explicar la asociación de esta enzima con la agresividad de este tipo de cáncer. En definitiva, la CPA4 funcionaría en el procesamiento de neuropéptidos a nivel extracelular. El tercer trabajo comprende el desarrollo de una nueva aproximación proteómica para el estudio de las preferencias de sustrato de las carboxipeptidasas. Esta técnica, basada en la tecnología COFRADIC, permite aislar miles de productos de la acción de carboxipeptidasas sobre una librería de péptidos (generada a partir de un proteoma celular). Esta técnica permitió describir las poco caracterizadas preferencias de sustrato de la carboxipeptidasa de mastocitos. En el cuarto trabajo se aplicó una técnica proteómica denominada “COFRADIC C-terminal” que permite la búsqueda de sustratos naturales de carboxipeptidasas. En particular, esta técnica se aplicó a la búsqueda de sustratos naturales de la carboxipeptidasa citosólica 1 (CCP1), la cual estaría asociada a mecanismos de degeneración y regeneración neuronal que aún se desconocen. Se ha propuesto que CCP1 tiene como sustratos a la tubulina y a otras proteínas que presentan residuos de glutámico en su extremo C-terminal. En este trabajo se pudieron identificar 7 nuevos posibles sustratos protéicos para CCP1.