Resumen de Kinetic and proteomic identification of protease inhibitors in marine invertebrates. Characterization of a carboxypeptidase inhibitor isolated from the mollusc nerita versicolor
Giovanny Covaleda Cortés
El presente trabajo describe la identificación cinética de actividad inhibidora de carboxipeptidasa A (CPA), carboxipeptidasa B (CPB), pepsina, papaína, tripsina y subtilisina en 30 extractos de invertebrados marinos del Caribe. Los resultados cualitativos mostraron catorce extractos con actividad inhibidora de tripsina, nueve extractos con actividad inhibidora de CPA, CPB, papaína y subtilisina, y sólo cuatro extractos con actividad inhibidora de pepsina. Los extractos más prometedores fueron seleccionados en términos de actividad inhibidora específica, relación dosis-respuesta, IC50 y biodisponibilidad de la especie. Por otra parte, Intensity Fading MALDI-TOF MS, un método proteómico utilizado en este trabajo para completar la estrategia de identificación de inhibidores de proteasas en extractos marinos, resultó ser muy útil para detectar moléculas, capaces de interactuar selectivamente con enzimas diana inmovilizadas, como fue el caso de N. versicolor frente a CPA y CPB, H. carunculata con pepsina, S. helianthus con papaína, N. peloronta y S. helianthus con tripsina y L. isodyctialis con subtilisina. Este trabajo también describe la aplicación de la fragmentación mediante MALDI-TOF MS en una estrategia de caracterización utilizando moléculas resueltas obtenidas en la fracción de elución de IF MALDI-TOF MS. Dos ejemplos son descritos: el primero es con el pico mayoritario obtenido de la interacción entre H. carunculata y pepsina-NHS Sepharose™, fragmentado mediante CID MALDI-TOF/TOF y analizado mediante secuenciación de novo. Otro ejemplo emplea la fragmentación ISD MALDI-TOF MS con la fracción de elución de S. helianthus y tripsina-glioxal Sepharose®. Otro objetivo de este trabajo fue la purificación y caracterización estructural – funcional de NVCI, un inhibidor proteico de carboxipeptidasa aislado del caracol marino N. versicolor. La combinación de técnicas tales como la degradación automatizada de Edman y secuenciación de novo por MALDI-TOF MS permitió el establecimiento de su estructura primaria. La síntesis y clonación del ADNc de NVCI permitió confirmar su secuencia de aminoácido. NVCI es una proteína con 53 residuos de aminoácidos, una masa molecular de 5944 Da y tres puentes disulfuro (código UniProt: P86912). NVCI recombinante fue producido en Pichia pastoris con un alto rendimiento en términos de proteína y actividad. NvCI natural y recombinante mostraron valores de Ki en el intervalo picomolar frente a carboxipeptidasas, tales como bCPA1, hCPA1 y hCPA4. Otros valores de Ki estuvieron en el orden de 1x10-10 M (hCPB1, pCPB1, hTAFI y bTAFI), con excepción de hCPA2 (1x10-9 M). NVCI es un inhibidor competitivo reversible de unión fuerte que representa el inhibidor de carboxipeptidasa más potente de naturaleza proteica descrito actualmente. La estructura de rayos X del complejo NvCI-hCPA4 (código PDB: 4A94) mostró que el inhibidor está formado básicamente por dos hojas ? centrales antiparalelas conectadas por tres bucles principales. Las hojas ? son estabilizadas mediante tres puentes disulfuro, un pequeño núcleo hidrofóbico situado junto al extremo C-terminal de NvCI y algunos residuos hidrófobos voluminosos expuestos al disolvente. NVCI tiene un área total de contacto de 1875,1 Å2 con la hCPA4. El mecanismo de inhibición de NVCI se debe a una interacción competitiva con el sitio activo de la carboxipeptidasa, por oclusión de los subsitios S1', S1, S2 y S3, tal como se ha observado para la mayoría de los inhibidores proteicos de carboxipeptidasa reportados anteriormente. Estos sitios están ocupados por el extremo C-terminal de NVCI y constituyen la región de contacto primaria del inhibidor. La zona de contacto secundaria está más extendida y cubre casi una cara del inhibidor. Los valores de Ki inferiores observados para NVCI en comparación con otros inhibidores se pueden atribuir tanto a las regiones de interacción "primaria" y "secundaria", que crean una interfaz extendida con la carboxipeptidasa que minimiza la liberación de producto de la reacción catalítica.
