Estructura de la cromatina a lo largo del ciclo celular. Aplicación de la crio-tomografía electrónica al estudio de la estructura de las placas de cromatina metafásica

• Autores: Andrea Chicano Jiménez
• Directores de la Tesis: Juan-Ramón Dabán Balañá (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Miquel Coll Capella (presid.), Josep Cladera i Cerdà (secret.), Montserrat Samsó (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD  TESEO 
• Resumen

  • La forma en que el filamento de nucleosomas alcanza diversos estadios de compactación y acaba formando el cromosoma metafásico al final del ciclo celular sigue siendo uno de los problemas más difíciles de resolver en el campo de la biología estructural. La fibra de 30 nm ha sido considerada durante mucho tiempo el segundo nivel de plegamiento de la cromatina, pero la mayoría de los modelos de plegamiento basados en fibras han sido propuestos a partir de estudios realizados en condiciones de muy baja fuerza iónica. Nuestro grupo de investigación ha realizado diversos estudios acerca de la estructura interna del cromosoma metafásico empleando diversas técnicas microscópicas, que han permitido observar un nuevo elemento de plegamiento: la placa de cromatina. El objetivo general de esta tesis es, por un lado, investigar la estructura de la cromatina durante la interfase en condiciones iónicas fisiólogicas y, por otro lado, obtener información estructural de alta resolución de las placas de cromatina observadas en cromosomas metafásicos. En primer lugar, se ha realizado un estudio de la estructura de la cromatina procedente de núcleos bajo condiciones iónicas propias de la interfase mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y se ha evaluado la capacidad autoasociativa de fragmentos de cromatina procedentes de núcleos interfásicos. En segundo lugar, se ha estudiado la estructura interna del cromosoma metafásico mediante la técnica de dispersión de rayos X de sincrotrón a bajo ángulo (SAXS). Por último, se ha obtenido información ultraestructural de la cromatina metafásica empleando la técnica de crio-tomografía electrónica (crio-ET). Los resultados de TEM muestran que la cromatina emanada de núcleos interfásicos presenta agregados amorfos y placas. El análisis de la estructura en las fases G1, S y G2 indica que las placas están presentes a lo largo de toda la interfase y que su compactación aumenta a medida que el ciclo celular avanza. En comparación con las placas metafásicas, las interfásicas son de dimensiones más reducidas y presentan menor tendencia al apilamiento. La falta de cohesión entre placas podría estar relacionada con el aumento de accesibilidad del DNA que se requiere durante los procesos de transcripción y replicación. Los experimentos realizados con fragmentos de cromatina interfásica indican una clara tendencia a autoasociarse para formar estructuras laminares. Al utilizar fragmentos procedentes de núcleos en fase G1, S y G2 se observa que las placas formadas en la interfase temprana son pequeñas y laxas, mientras que las placas en la interfase tardía presentan tamaños mayores y son más compactas. El análisis mediante crio-TE de la cromatina procedente de cromosomas metafásicos ha permitido observar que, en medio acuoso vitrificado, en ausencia de sustratos y en condiciones iónicas próximas a la metafase, la cromatina presenta una estructura laminar. Las placas de cromatina analizadas presentan un grosor de unos 10 nm, similar al diámetro del nucleosoma. En las placas desestructuradas pueden visualizarse nucleosomas como entidades individuales, pero en las placas compactas únicamente se observan líneas transversales que corresponden al DNA nucleosomal. La distancia entre estas líneas es de unos 5 nm, y es equivalente a la distancia entre las líneas visibles en el interior de nucleosomas individuales con diversas orientaciones. Estos resultados sugieren que los nucleosomas en las placas se disponen irregularmente. Frecuentemente, se ha observado que las placas pueden interaccionar a través de sus bordes, formando estructuras cilíndricas, o lateralmente, formando bicapas o multicapas. El grosor de dos placas en contacto es de 16 nm, que es significativamente menor que el grosor esperado para dos placas individuales (20 nm). De acuerdo con observaciones anteriores, estos resultados indican que los nucleosomas de ambas placas se interdigitan. En una estructura multilaminar interdigitada, los nucleosomas pueden interaccionar lateralmente. La distancia entre nucleosomas con interacción lateral es de 6 nm; equivalente a la distancia entre placas apiladas y que coincide con la difracción dominante a 6 nm observada en los experimentos de SAXS en condiciones iónicas metafásicas. Los resultados obtenidos refuerzan el modelo de las placas finas de cromatina para el cromosoma metafásico. La existencia de placas en interfase sugiere que, además de proteger el DNA, estas estructuras laminares deben participar en las diversas funciones de la cromatina a lo largo del ciclo celular.