Study of the transport mechanism of the melibiose permease from Escherichia coli

• Autores: Liying Wang
• Directores de la Tesis: Esteve Padrós i Morell (dir. tes.), Josep Cladera i Cerdà (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Pere Garriga Solé (presid.), Alejandro Perálvarez Marín (secret.), Fernando Gil-Ortiz (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Biofísica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DDD
• Resumen

  • El transportador de melibiosa d'Escherichia coli (MelB) pot utilitzar l'energia electroquímica tant de H+, Na+ o Li+ per transportar la melibiosa a l'interior de les cèl·lules en contra del seu gradient de concentració. La MelB és una proteïna de 473 aminoàcids disposats en 12 hèlices transmembrana, amb els extrems N- i C-terminal situats al costat citoplàsmic. Mitjançant l'ús de mètodes espectroscòpics i bioquímics, hem analitzat el paper d'alguns aminoàcids en el bucle 7-8/final d'hèlix VII, que conté diversos aminoàcids aromàtics altament conservats, així com dos residus carregats negativament. Aplicant tècniques de mutagènesi, es van obtenir mutants individuals en què cada aminoàcid s'ha canviat a cisteïna excepte Ser-259, que també es va canviar a alanina. L'espectroscòpia de fluorescència va mostrar que els mutants dels aminoàcids conservats Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 i Tyr-260 no uneixen substrats, i els espectres de diferència d'infrarojos de Y256C i Y260C van confirmar l’absència d’unió al substrat. Simulacions de dinàmica molecular van mostrar que aquests residus aromàtics formen part d'un bloc d’interaccions hidrofòbiques que jugaria un paper destacat en el mecanisme de transport. D'altra banda, els espectres de fluorescència i de diferència d’infraroig van demostrar que el mutant Cys del residu Asp-266 i del restant aminoàcid aromàtic del bucle 7-8 Phe-268 són capaços d'unir sodi i melibiosa en una forma semblant a la MelB nativa (Cless). Altres mutants de cisteïna (S259C, S259A, V261C, G263C, D264C, A265C i L267C) del bucle 7-8/final d'hèlix VII mostren una capacitat d'unió similar a Cless. Aquests resultats suggereixen que els aminoàcids conservats Tyr-256, Tyr-257, Phe-Tyr-258 i 260 tenen un paper estructural important en el mecanisme de transport de la MelB.