Nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN) com a sistema d’elecció per a transfecció cel·lular de DNA/RNA

• Autores: Anna Fàbregas Fernández
• Directores de la Tesis: Carles Suñé Negre (dir. tes.), Montserrat Miñarro Carmona (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Alfonso del Pozo Carrascosa (presid.), Jaume Piulats Xancó (secret.), Antoni Esteve Cruella (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Ácidos nucleicos
  • Ciencias médicas
    • Farmacología
      • Preparación de medicamentos
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Davant la necessitat de nous enfocaments en el tractament de determinades malalties, en els darrers anys s’han desenvolupant sistemes nanoestructurats no virals com a vehiculitzadors d’agents terapèutics -entre els que es troben els àcids nucleics- com a alternativa tant a les formes farmacèutiques clàssiques com als sistemes virals, els quals presenten riscos associats que no compensen els eventuals beneficis. Entre els diversos tipus de sistemes no virals per a transfecció d’àcids nucleics (DNA i RNA) dirigits a la regulació de l’expressió gènica, es troben les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP i les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN). El diàmetre mitjà de les nanopartícules i el potencial superficial obtingut (entès com a potencial Z) són variables clau per determinar la seva idoneïtat per a l’ús previst. Les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP s’obtenen majoritàriament pel mètode de gelificació ionotròpica. En aquest treball, s’han optimitzat certs paràmetres operacionals del mètode per tal de reduir el temps de síntesi i aconseguir nanopartícules de mida i potencial Z adients. Enfront la variabilitat que presenta aquesta classe de sistema nanoparticulat, i molt particularment a causa de la puresa i grau de desacetilació de la matèria primera, es proposa l’estudi d’un sistema alternatiu per a transfecció d’àcids nucleics. Aquest sistema d’elecció són les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN), obtingudes pel mètode la microemulsificació en calent. A partir d’una formulació original, i per tal de reduir al màxim els components de la formulació i per tant, els riscos de citotoxicitat, s’avaluen diferents components i la quantitat mínima necessària a la formulació, sense comprometre ni la mida de partícula ni el potencial Z. La caracterització dels components i les seves interaccions, així com la determinació de les propietats de la formulació resultant per mitjà de diverses tècniques instrumentals, indiquen la idoneïtat de les cSLN per a l’ús previst. Els estudis de citotoxicitat en les línies cel·lulars HEK293T i HeLa demostren que la viabilitat cel·lular no es veu compromesa per la presència de cSLN en determinades quantitats. A partir de plasmidis d’expressió eucariota, es determina per mitjà d’assajos de retardament en gel la relació òptima cSLN:pDNA per a un 100% d’eficiència d’unió. A partir d’aquesta dada, es porten a terme estudis d’expressió funcional d’un fragment del gen que codifica per al factor de transcripció TCERG1 per mitjà d’immunoblotting, i del gen Luc que codifica per a l’enzim luciferasa per mitjà d’un assaig de bioluminescència, que demostren l’expressió proteica a partir de la transfecció de lipoplexos cSLN:pDNA. Així mateix, i a partir d’un fragment de siRNA contra TCERG1, s’estableix la relació òptima cSLN:siRNA per a un 100% d’eficiència d’unió. En aquest cas, l’estudi es complementa amb l’avaluació de l’eficiència de transfecció dels lipoplexos cSLN:siRNA. Es pot concloure que el siRNA és capaç d’arribar a la cèl·lula quan s’utilitzen cSLN com a agent de transfecció, obrint la porta a la possibilitat de regulació de l’expressió gènica a partir de lipoplexos cSLN:siRNA.