Resumen de Biochemical and molecular study of the Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal proteins (Vip3A) mode of action in Spodoptera species
Maissa Chakroun
Las proteínas insecticidas vegetativas (Vip) constituyen una nueva familia de toxinas producidas durante la fase de crecimiento vegetativo de diferentes cepas de Bacillus y principalmente por Bacillus thuringiensis (Bt). Esta familia de proteínas está representada por 4 miembros: Vip1, Vip2, Vip3 y la recientemente descrita Vip4. Las toxinas binarias Vip1 y Vip2 son activas contra coleópteros y homópteros; las proteínas Vip3 son activas contra lepidópteros, sin embargo, los insectos diana para la proteína Vip4 no se conocen todavía. La determinación del modo de acción de Vip1 y Vip2 fue fácil ya que mostraron una homología de secuencia significativa con las toxinas clostridiales C2 y C3, respectivamente. Éste no fue el caso de Vip3. Las proteínas Vip3 no han mostrado ninguna homología de secuencia significativa con ninguna de las proteínas descritas en las bases de datos. Tampoco se encontró en su secuencia ningún dominio característico con actividad tóxica conocida, por lo que no se pudo inferir su modo de acción. En este trabajo se estudian las principales etapas del modo de acción de las proteínas Vip3A en un intento de ampliar los conocimientos adquiridos hasta el momento sobre estas proteinas. En el presente estudio se evaluó la estabilidad de Vip3Aa respecto a diversos procesos de purificación, tras lo cual se investigó dos pasos de su modo de acción: la activación por el jugo intestinal de las especies susceptibles Spodoptera frugiperda y Spodoptera exigua y la unión a sus receptores específicos localizados en el intestino medio de S. frugiperda. El efecto de varios protocolos de purificación de Vip3Aa sobre su toxicidad fue analizado utilizando S. frugiperda como insecto control. La proteína Vip3Aa fue estable y retuvo total toxicidad después de los diferentes pasos bioquímicos usados para su purificación. Los bioensayos utilizando la Vip3Aa en forma protoxina mostraron diferencias marcadas en los valores de LC50 (anotados a los 7 y 10 días) entre S. exigua (menos susceptible) y S. frugiperda. Se observó una fuerte inhibición del crecimiento a los 7 d y la mayoría de las larvas vivas detuvieron su crecimiento en el primer estadio larvario (L1). Los valores de LC50 de la '' mortalidad funcional '' (larvas muertas más larvas en L1), medidos a 7 d, fueron similares o incluso inferiores a los valores de la LC50 de la mortalidad a los 10 d. Sin embargo, cuando se utilizó la Vip3Aa activada por tripsina, no se observó inhibición del crecimiento, y ambas especies fueron igualmente susceptibles a esta forma. El procesado de la protoxina de Vip3Aa a la forma activada fue más rápido con el jugo intestinal de S. frugiperda que con el de S. exigua, lo que sugiere que la diferencia en la tasa de activación de Vip3Aa entre las dos especies podría ser la base de la diferencia de susceptibilidad a la protoxina. Por contra, Vip3Ae resultó ser igualmente tóxica para estas dos especies. Se realizaron experimentos de proteolisis para estudiar la estabilidad de las proteínas Vip3A frente a las peptidasas intestinales y observar si las diferencias encontradas podrían explicar las diferencias en la toxicidad contra estas dos especies de Spodoptera. Los resultados indicaron que la activación de la protoxina y la degradación de la banda de 62 kDa tenía lugar a concentraciones más bajas de tripsina para Vip3Aa que para Vip3Ae. El efecto opuesto se observó con la quimotripsina. Cuando se usó jugo intestinal de ambas especies de Spodoptera, las protoxinas Vip3Aa y Vip3Ae fueron inmediatamente procesadas y no se encontró ningun péptido resistente a las peptidasas intestinales en las condiciones experimentales utilizadas. Los experimentos de digestión realizados con las serín peptidasas de S. frugiperda purificadas por cromatografía mostraron que la degradación del fragmento activo de las toxinas Vip3A se debe principalmente a la acción de la peptidasa de tipo quimotripsina catiónica. Aunque los patrones de digestión de las proteínas Vip3A no siempre se correlacionan con la toxicidad; la estabilidad del fragmento de 62 kDa a las peptidasas está de acuerdo con las diferencias intraspecíficas de la toxicidad de la proteína Vip3Aa. La unión in vivo de Vip3Aa al intestino medio de S. frugiperda mediante la localización histológica por immuno-fluorescencia mostró que la Vip3Aa se une a lo largo de toda la superficie apical de la membrana del borde en cepillo de las células intestinales. La presencia ténue de fluorescencia verde en el citoplasma de las células epiteliales parece sugerir internalización de Vip3Aa o un fragmento de la misma. El éxito del radiomarcaje de Vip3Aa ha hecho posible el análisis in vitro de sus características y parámetros de unión. La competencia heteróloga de 125I-Vip3Aa con Vip3Ad, Vip3Ae y Vip3Af mostró que estas proteínas comparten los mismos sitios de unión en S. frugiperda. Por contra, cuando se utilizaron Cry1Ab y Cry1Ac como competidores no se observó unión competitiva. El presente trabajo ayudará a comprender mejor la base molecular de la resistencia a las toxinas Vip3A introducidas recientemente en plantas y así ayudar a diseñar estrategias apropiadas de manejo de resistencia a los insecticidas para uso continuado de las toxinas Bt en cultivos transgénicos.
