Resumen de Aplicación de la resonancia magnética nuclear de sistemas paramagnéticos a la determinación de propiedades estructurales y dinámicas de las proteínas rusticianina y calbindina DqK

Beatriz Jiménez Garrido

• español

  La presente tesis muestra la potencialidad de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) aplicada a sistemas paramagnéticos a la hora de determinar propiedades estructurales, moleculares y dinámicas de los sistemas de estudio. La RMN paramagnética er información en las proximidades del entorno metálico. En esta Tesis se demuestra, sin embargo, que el paramagnetismo en RMN proporciona datos estructurales (derivados de las velocidades de relajación, de los desplazamientos de pseudocontacto y de los acoplamientos dipolares residuales) que compensan y superan la pérdida de información por relajación.

  Los sistemas de estudio han sido la proteína azul de cobre (BCP) rusticianina (Rc) y la proteína activadora de calcio calbindina D9k (Cb). Rc es la BCP con el mayor potencial redox (680 mV), siendo, asimismo, muy estable a valores de pH extremadamente ácidos. Hemos caracterizado la interacción del metal con sus ligandos mediante estudios de RMN paramagnética tanto del sistema nativo, Cu(II), como del derivado de cobalto(II). La estructura electrónica del ion cobre viene determinada por la interacción de éste con los ligandos histidina, mientras que la interacción del cobre con los ligandos cisteína y metionina es debido al plegamiento global y en las proximidades del entorno metálico de la proteína. La -SgCys es tanto más fuerte cuanto más cerca está el ion metálico del plano NHisNHisSCys formado por los átomos dadores de los ligandos ecuatoriales. El estudio de mutantes de Rc en la metionina axial revelan que aquellos aminoácidos que proporcionan al cobre tetraédrica (mutantes de glutamina, glutamato y cisteína) desplazan al cobre de ese plano y disminuyen la velocidad de autotransferencia electrónica. Mutantes en esta metionina que obligan al cobre a permanecer en dicho plano (leucina) favorecen la velocidad de transferencia electrónica. Por otra parte, hemos constatado en la presente Tesis que el elevado potencial redox de Rc es consecuencia del alto entorno hidrofóbico que rodea al metal. Así mismo, hemos estudiado las características d hidratación de esta proteína mediante RMN heteronuclear 1H-15N. Rc es la más rígida e hidrofóbica entre las BCPs. Estas dos singularidades están relacionadas con su gran estabilidad a bajo pH.

  El otro sistema con el que hemos trabajado, la proteína Cb, nos ha servido como modelo para determinar la relevancia de las restricciones paramagnéticas en el cálculo de estructuras de proteínas en disolución. El empleo adecuado de estas restricciones nos ha permitido obtener una estructura con una muy buena resolución (la desviación estándar de la familia de estructuras obtenida era 0.25 Å). También hemos realizado estudios de desplegamiento de la proteína en presencia de agente desnaturalizante. En este estado incipiente desnaturalizado, el núcleo hidro compacto, conservando completamente su estructura terciaria. Éste es uno de los factores que influyen en la gran estabilidad de la proteína. Hemos puesto de manifiesto que los iones metálicos son esenciales en la estabilidad estructural de la calbindina D9k. De hecho, hemos relacionado la mayor movilidad de los lazos en ausencia de iones metálicos con pequeños cambios estructurales y con la rotura de interacciones terciarias fundamentales. Estos cambios pueden ser la causa de la disminución drástica de la estabilidad de apo-Cb con respecto a la calbindina metalada.

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• English

  Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is the only methodology that allows the procurement of detailed, high quality structural information of biomolecules in solution at atomic level. NMR permits, as well, the complete dynamic characterization of a protein, and the acquaintance of its hydration properties.

  When working with NMR, substantial advantages can be derived from the existence of paramagnetic ions. The paramagnetism provides essential structural information not only from the metal site surroundings, but also from the whole protein.

  This PhD Thesis represents an exhaustive example of this last statement. Two different and complementary aims were pursued and reached in this Thesis. The first one was methodological. We apply NMR to paramagnetic systems in order to obtain information on the electronic properties of the metal, on the structure of the whole systems, and also on its dynamic features. The second one was strictly biochemical. We have characterised the blue copper protein rusticyanin (Rc) and the calcium binding protein calbindin D9k (Cb) by paramagnetic NMR and we have correlated structural and dynamic aspects of each protein with their functional properties.

  We have characterized the metal-ligand interplay in Rc by paramagnetic NMR studies on the copper(II) native protein, the cobalt(II) derivative, and also on five different mutants. The electronic structure of the copper ion is defined by the orientation of the histidine ligands, while the interaction of the copper ion with the cysteine and the methionine ligands is independently determined by the protein folding around the metal site. We have also stated in the present Thesis that the high redox potential of Rc is due to the high hydrophobic environment of the copper ion. Studying dynamic and hydration features of Rc by 1H-15N NMR we can assert that it is the most rigid and hydrophobic BCP.

  We have selected monocerium(III) substituted Cb to study the relative importance of paramagnetism-based constraints with respect to classical ones in solution structure determinations of paramagnetic metalloproteins. The adequate use of these constraints gave us a very refined structure(RMSD=0.25 Å). We have also monitored the unfolding of the calbindin D9k by 1H and heteronuclear NMR. The hydrophobic core of the protein shows a tighter packing at GdmHCl 2 M. This is one of the main factors for the great stability of the protein.