Resumen de Optimization of flow cytometry assays for the detection of injured foodborne pathogenic bacteria
Nowadays, one of the key factors driving consumer food choice is convenience. This has led to an increase in the ready-to-eat (RTE) meal market, with a consequent emergence of new food safety hazards, since food processing and preservation technologies that may be applied to these food products have a milder effect on microorganisms than traditional food processing strategies (e.g. pasteurization, sterilization). As a result, some of those technologies render injured bacteria, which may lose their ability to multiply and are therefore not detected by conventional plating. However, their presence in food must not be overlooked, due to their potential capacity to recover and pose a hazard to health in the case of pathogens. Flow cytometry is a culture-independent technique which has been widely used in bacterial research to rapidly assess the physiological state of individual cells, with membrane integrity being one of the most popular parameters due to its essential role in survival. However, flow cytometry results are largely affected by the interference of food particles. In this thesis, several strategies were evaluated to develop a flow cytometry assay, based on the use of the membrane-impermeant dye propidium iodide (PI) combined with a membrane-permeant dye, to accurately detect and enumerate injured pathogenic bacteria. In the first experiment, concentrations and ratios of combinations of PI with SYTO 9, SYTO 24, and SYTO BC were adjusted to improve resolution of healthy and dead Escherichia coli O157:H7, Salmonella Enteritidis and Listeria monocytogenes populations in control suspensions. This allowed detection of injured cells in suspensions exposed to food-related stresses. In the second experiment, optimized stainings were applied to RTE pasta salad samples inoculated with E. coli O157:H7. Moreover, eight different salad sample pre-treatments based on coarse filtration of homogenates and a dilution/wash step were compared in terms of background particle reduction and E. coli O157:H7 recovery. The most advantageous pre-treatment was the combination of a 63-µm filter blender bag and centrifugal filtration through a 5-µm filter, since it was equivalent to sample dilution in reducing background particle concentration. Considering that the ultimate goal of this thesis was to detect specific injured pathogen cells in RTE pasta salad, in the third experiment, optimization was carried out for E. coli O157:H7 control suspensions in buffers commonly used in immunoassays and stained with the high-affinity nucleic acid dye SYBR Green I, PI, and an R-phycoerythrin-labeled antibody (Ab-RPE). Addition of Ab-RPE did not remarkably affect population resolution compared with staining only with SYBR Green I and PI, and allowed clear recognition of E. coli O157:H7. Finally, in the fourth experiment, a range of signal filtering strategies were evaluated for reduced acquisition of flow cytometry data arising from interfering food particles. Then, optimized salad sample pre-treatment, combined membrane integrity and immunodetection staining, and signal filtering were applied to monitor the changes in membrane integrity of E. coli O157:H7 inoculated in pasta salad throughout 14-day refrigerated storage (pH 4.5, 4°C). With this optimized flow cytometry protocol, the limit of detection of the assay was reduced to 5 log CFU/g. Additionally, it was observed that most E. coli O157:H7 cells were injured at the beginning of refrigeration, but showed an intact membrane at the end, which suggests that injured cells repaired their membrane during exposure to refrigeration and acid stresses, and therefore survived in RTE pasta salad. In conclusion, the immunodetection and membrane integrity flow cytometry assay in food samples developed in this thesis is a good tool to monitor the effect of a number of food-related treatments on E. coli O157:H7 cell membrane state, a physiological parameter that can be related to the presence of injured cells. Algunos tratamientos de elaboración y conservación de los alimentos lesionan las bacterias, de manera que pierden la capacidad para multiplicarse y no son detectadas por métodos de cultivo convencionales. La citometría de flujo es una técnica de análisis independiente del cultivo de los microorganismos, usada ampliamente para evaluar de manera rápida el estado fisiológico de células bacterianas individuales, siendo la integridad de membrana unos de los indicadores más habituales debido a su importancia en la supervivencia de éstas. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante citometría de flujo se ven afectados por la presencia de partículas de las muestras alimentarias. En esta tesis, se evaluaron estrategias para desarrollar un ensayo por citometría de flujo basado en el uso del yoduro de propidio (YP), fluorocromo que no atraviesa las membranas intactas, combinado con un fluorocromo que penetra las membranas intactas, para detectar y cuantificar con precisión bacterias patógenas lesionadas. En el primer experimento, se ajustaron las concentraciones y las ratios de combinaciones de YP con SYTO 9, SYTO 24 y SYTO BC para mejorar la resolución de poblaciones de células sanas y muertas de Escherichia coli O157:H7, Salmonella Enteritidis y Listeria monocytogenes en suspensiones control. Esto permitió detectar células lesionadas en suspensiones expuestas a estreses relacionados con los alimentos. En el segundo experimento, se aplicaron las tinciones optimizadas a muestras de ensalada de pasta inoculadas con E. coli O157:H7. Asimismo, se compararon ocho pre-tratamientos basados en la filtración gruesa de las muestras homogeneizadas y en un paso de dilución/lavado, para evaluar la reducción de partículas interferentes y la recuperación de E. coli O157:H7 de la ensalada. El pre-tratamiento más favorable fue la combinación de la bolsa de homogenización con filtro de 63 µm y la filtración centrífuga a través de un filtro de 5 µm, ya que redujo la concentración de partículas interferentes tanto como diluir la muestra. Considerando que el objetivo principal de esta tesis fue detectar específicamente bacterias patógenas lesionadas, en el tercer experimento, la optimización se llevó a cabo para suspensiones control de E. coli O157:H7 en soluciones tampón comúnmente usadas en inmunoensayos, y teñidas con SYBR Green I, un fluorocromo con alta afinidad por los ácidos nucleicos, YP y un anticuerpo marcado con R-ficoeritrina (Ac-RFE). La adición de Ac-RFE no afectó notablemente la resolución de las poblaciones en comparación con la resolución conseguida con la tinción con SYBR Green I y YP, y permitió reconocer claramente las células de E. coli O157:H7. En el cuarto experimento, se evaluaron estrategias de filtración de señal analítica para reducir la adquisición de datos procedentes de partículas interferentes. Posteriormente, se aplicó el pre-tratamiento de muestra optimizado, la tinción para evaluar la integridad de membrana y la inmunodetección, y la filtración de señal analítica, para monitorizar los cambios de la integridad de membrana de E. coli O157:H7 inoculada en ensalada de pasta durante 14 días de almacenamiento en refrigeración (pH 4,5; 4°C). Con este protocolo optimizado, el límite de detección disminuyó a 5 log UFC/g. Además, se observó que la mayoría de células de E. coli O157:H7 estaban lesionadas al principio del almacenamiento, pero mostraban una membrana intacta al final, lo que sugiere que las células lesionadas repararon su membrana durante la exposición a ácido y refrigeración y, por lo tanto, sobrevivieron en la ensalada de pasta. En conclusión, el ensayo por citometría de flujo para la evaluación de la integridad de membrana y la inmunodetección desarrollado en esta tesis es una buena herramienta para monitorizar el efecto de tratamientos relacionados con los alimentos sobre el estado de la membrana de E. coli O157:H7, parámetro fisiológico relacionado con la presencia de células lesionadas.
