Estudi de la composició de la quasiespècies del virus de la hepatitis B a les regions codificants de les proteïnes de l’envolta i la polimerasa viral per sequ?enciació massiva: associació de les seves variants genètiques amb el tractament antiviral de la hepatitis B crònica amb anàlegs de nucleòsids/nucleòtids
- Autores: David Tabernero Caellas
- Directores de la Tesis: Francisco Rodríguez Frías (dir. tes.), Anna Messeguer Navarro (dir. tes.), María Buti Ferret (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rosina Gironés Llop (presid.), Francesca Canalias Revertes (secret.), Ricardo Flores Pedauye (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
Aquesta tesi doctoral es basa en dos estudis en els que s’analitzen les variants genètiques de la quasiespècies del virus de la hepatitis B (VHB) en una regió de la pauta oberta de lectura (ORF) de la polimerasa viral (P) on poden acumular-se mutacions relacionades amb la resistència a certs tractaments de la família dels anàlegs de nucleòsids/nucleòtids (NUCs). Aquesta anàlisi s’ha realitzat per seqüenciació massiva basada en tècniques d’“Ultra-deep pyrosequencing” (UDPS). Les mutacions seleccionades a causa del tractament antiviral a l’ORF P també poden produir canvis d’aminoàcid (aa) a l’ORF de les proteïnes de superfície (S) [tots dos ORF estan solapats a la mateixa seqüència de nucleòtids (nt)]. Alguns d’aquests canvis poden donar lloc a la pèrdua de l’acció protectora de la vacunació i/o les immunoglobulines contra el VHB (HBIg) i també a falsos negatius en els mètodes diagnòstics del VHB. En el primer estudi s’han analitzat la quasiespècies del VHB en quatre pacients amb hepatitis B crònica abans de rebre qualsevol tractament amb NUCs. Un d’aquests pacients va rebre tractament seqüencial amb diferents NUCs i es va analitzar una mostra obtinguda en finalitzar cada un d’ells. Aquestes quasiespècies virals van ser estudiades amb la primera versió de la tecnologia d’UDPS, que permetia lectures de seqüència fins a 250 nt. La metodologia desenvolupada en aquest estudi va permetre determinar la composició de variants genètiques en proporcions fins al 0,1% de la quasiespècies. Es va analitzar la variabilitat i conservació dels ORFs P i S en la quasiespècies viral abans del primer tractament amb NUCs dels quatre pacients inclosos a l’estudi [lamivudina (LAM)]. En general, la freqüència de les mutacions relacionades amb resistència a LAM no va permetre preveure la seva selecció durant aquest tractament. En el pacient analitzat longitudinalment, al llarg dels diferents tractaments es van analitzar les divergències globals de les seqüències de nt i aa i la desviació estàndard (SD) de les freqüències de les mutacions a l’ORF P. La SD va permetre identificar les més rellevants per explicar la fallada a cada un d’aquests (per tant aquests resultats tenen un valor potencialment fenotípic). L’anàlisi del lligament d’aquestes mutacions va evidenciar l’acumulació de varies d’elles en una sola variant genètica (per exemple rtL180M-rtS202G-rtM204V-rtV207I), a excepció de rtA181T/sW172stop que sol ser la única mutació en les variants que la contenen. En totes les mostres analitzades es van observar proporcions relativament elevades de variants defectives amb codons stop prematurs a l’ORF S. En el segon estudi es va analitzar la quasiespècies viral en quatre pacients amb recurrència de la infecció per VHB després del trasplantament hepàtic ortotòpic (OLT) a pesar de la profilaxi amb LAM o HBIg+LAM. En aquest estudi es va utilitzar una nova metodologia descrita prèviament pel grup del doctorand, que va permetre estudiar les variants presents en proporcions fins al 0,25% de la quasiespècies del VHB. Aquest procediment està basat en una versió de la tecnologia d’UDPS que permet obtenir seqüències fins a 400 nt, cosa que va fer possible explorar la seqüència sencera del principal epítop de l’antigen de superfície del VHB (HBsAg), el determinant “a”. Així en els quatre casos estudiats es va observar un efecte coll d’ampolla de l’OLT sobre les poblacions de variants que formen la quasiespècies del VHB, que va donar lloc a diferències rellevants entre les quasiespècies d’abans i després de l’OLT: a nivell de mutacions individuals dels ORFs P i S, que en alguns casos van donar lloc a la recurrència de la infecció sense HBsAg detectable, i a través de canvis en el genotip del VHB i en diferents índexs de diversitat de la quasiespècies viral.
