Resumen de Chromatin regulatory mechanisms of gene expression at mononucleosomal level: nucleosome occupancy and epigenetic modi?cations
La cromatina es una compleja estructura compuesta por DNA, RNA y proteínas, que permite compactar el genoma en las células eucariotas. Siendo el cromosoma el nivel más alto de compactación y el nucleosoma la subunidad fundamental de la misma. El nucleosoma está compuesto por un octámero de histonas, siendo H2A, H2B, H3 y H4 las canónicas. Este octámero se encuentra envuelto por 147 pb de DNA doble cadena. Entre los nucleosomas se encuentra una zona de DNA ?anqueante y la histona H1 (o H5 en algunos casos), que principalmente cumple una función en la estabilidad del nucleosoma. La estructura de la cromatina tiene un papel crucial en la regulación de todos los procesos celulares que implican al DNA, entre ellos, la transcripción. En este sentido, la dinámica nucleosomal representa un nivel adicional de la regulación transcripcional. Los cambios epigenéticos que ocurren en las histonas, mayoritariamente en la cola N-terminal, ayudan o promueven que el nucleosoma sea desplazado, parcialmente desensamblado o reestructurado durante la transcripción. Esto es posible, ya que la combinación de eventos de modi?cación de histonas, crea una super?cie de unión para complejos proteicos especí?cos. Esta combinación de eventos es denominado como código de histonas. Los tipos de modi?caciones estudiados frecuentemente son la acetilación, la metilación y la fosforilación de histonas. La acetilación consiste en la adición de un grupo acetilo al grupo amino de la cadena lateral del residuo lisina (K-ac). Esta reacción es realizada por las proteínas histona acetiltransferasas (HATs) y el proceso contrario, denominado desacetilación, es catalizado por las proteínas histona deacetilasas (HDACs). Este tipo de modi?cación epigenética se encuentra relacionada con la activación de la transcripción. La metilación corresponde a la adición de uno, dos o tres grupos metilo, al átomo de nitrógeno de las cadenas laterales de los aminoácidos arginina (R-me1, R-me2, R-me3) y lisina (K-me1, K-me2, K-me3). Esta reacción es catalizada por las enzimas lisina metiltransferasas (PKMTs) y arginina metiltransferasas (PRMTs) y el proceso contrario es catalizado por las histona desmetilasas. Esta modi?cación se encuentra involucrada tanto en activación como en represión génica. Por otro lado, la fosforilación consiste en la adición de un grupo fosfato al grupo hidroxilo de los residuos serina (Sph), treonina y tirosina (T-ph). Esta reacción es catalizada por las proteínas quinasas y el proceso contrario lo es por las proteínas fosfatasas. Esta modi?cación está implicada en múltiples procesos celulares. Estos eventos de modi?cación en las histonas, permiten reclutar, entre otros, los complejos remodeladores. Los remodeladores actúan, junto con otros factores, empaquetando y desempaquetando el DNA. Se distinguen cuatro familias de remodeladores en eucariotas: SWI/SNF, ISWI, CHD y INO80. Cada una posee un papel particular, por ejemplo, la familia SWI/SNF esta´ implicada en el desplazamiento y en la salida del nucleosoma, mientras que la familia ISWI se encarga del ensamblaje de los nucleosomas. Por lo tanto, la estructura de la cromatina y los cambios dinámicos de esta, constituye un nivel adicional en la regulación de la transcripción en células eucariotas. La transcripción es el proceso por el cual la información del DNA es transferida al RNA. En el contexto del presente trabajo se describe solo la transcripción de los genes estructurales, proceso que es catalizado por la RNA pol II y tiene lugar en la eucromatina. El proceso de síntesis del RNA mensajero involucra una compleja maquinaria transcripcional y se divide en tres etapas: iniciación, elongación-ayuste y terminación. En cada una de estas etapas, la regulación epigenética es fundamental. La etapa de iniciación empieza con la formación del complejo de preiniciación (PIC), que involucra una serie de procesos altamente ordenados. Una vez que los factores de unión al DNA, llamados factores trans, se unen a secuencias especí?cas en el promotor del gen, llamados elementos cis, se inicia una cascada de reclutamiento de complejos coactivadores, entre los que se encuentran enzimas modi?cadoras de histonas, remodeladores y el complejo mediador. Este último constituye un puente entre los factores de transcripción en trans especí?cas del gen unidos a sus sitios cis y los factores generales de la maquinaria de transcripción, que incluyen TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, y TFIIH. Un modelo de como la cromatina podría estar implicada en la formación del PIC, considera que un elemento en trans reconoce y se une a una zona libre de nucleosoma en el promotor del gen. Este elemento en trans, es reconocido por coactivadores como son los remodeladores de la familia SWI/SNF y algunas HATs, lo que resulta en la hiperacetilación de H3 y H4 en la región del promotor proximal, aumentando la movilidad de los nucleosomas. Este hecho junto con el posible remplazo de histonas, regularía la iniciación de la transcripción. Tras la formación del PIC y la posterior fosforilación del CTD, comienza la etapa de elongación. En el inicio de esta etapa, en genes inmediato tempranos, la polimerasa puede estar pausada y ser activada por algunas señales. Durante la elongación, el DNA aguas abajo se separa para proporcionar acceso al sitio activo de la RNA pol II y posteriormente al paso de la enzima se enrolla nuevamente aguas arriba. En este sentido, los nucleosomas representan una barrera en la síntesis del RNA, por lo que deben ser parcial o totalmente expulsados y reestructurados durante la transcripción. En consecuencia debe existir una so?sticada gama de factores que controlen la estructura de la cromatina. Por todo lo expuesto aquí, actualmente se propone que la estructura de la cromatina es uno de los elementos reguladores fundamentales en el mecanismo de la elongación transcripcional. Las modi?caciones de fosforilación en las serinas 5 y 2 podrían estar promoviendo la activación de la polimerasa que, como se menciona anteriormente, se encuentra pausada en algunos genes. A su vez, estas modi?caciones estarían involucradas en la alteración de la estructura de la cromatina. Un gran número de factores están participando de esta regulación (ver Fig. 1.9). Entre los cuales se encuentran metiltransferasas como Set2, que cataliza la acumulación de H3K4me3 en el 5’ ?nal del ORF y la H3K36me3 en el extremo 3’. Las HATs son reclutadas delante de la RNApol II, inducen acetilación de las histonas lo que, junto con la acción de las chaperonas de histonas, contribuye al desensamblaje y reensamblaje de los dímeros H2A/H2B de los nucleosomas, desestabilizándolos y facilitando el procesamiento por la RNApolII con la ayuda de remodeladores. Finalmente, la H3K36me3 es reconocida por el cromo-dominio de las desacetilasas, desacetila los nucleosomas y los estabiliza después de la transcripción. El potencial mecanismo establecido anteriormente puede explicar más o menos la compleja maquinaria requerida para que la RNApol II para llevar a cabo la síntesis de mRNA durante la elongación. Sin embargo, como es también conocido el mRNA maduro no incorpora todo el mRNA sintetizado, y se precisa un procesado del mismo mediante ayuste que transcurre simultáneamente a la elongación de la transcripción. El ayuste se de?ne canónicamente como el proceso por el cual los intrones de un gen, que se está transcribiendo en el mRNA naciente, son eliminados para obtener un mRNA maduro. Este proceso se lleva a cabo por el ayustosoma, compuesto por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares y otros factores de ayuste (SFs). El ayustosoma reconoce los elementos cis en las zonas ?anqueantes entre el intrón-exón correspondiente. Sin embargo, los 20.000-25.000 genes identi?cados que codi?can proteínas en el genoma humano no explican la gran diversidad de proteínas en las células eucariotas, por lo que se conoce que más del 90% de los genes presentan ayuste alternativo. Se han identi?cado varios tipos de ayuste alternativo entre los que se encuentran la omisión de exón (ES), la retención de intrón (IR), el sitio 3’ (A3SS) y el sitio 5’ de empalme alternativo (A5SS), y el sitio de poli-adenilación alternativo (PAS), entre otros. El mecanismo por el cual el ayuste alternativo se lleva a cabo aún no está del todo claro, pero se sabe que la dinámica de la cromatina participa en la regulación del mismo (ver Fig. 1.10 y 1.12). Usualmente, los exones cortos se encuentra formando parte de un nucleosoma y se cree que se debe a la composición de nucleótidos de estas zonas. Esta área también se caracteriza por la presencia de algunas modi?caciones epigenética, como son: H2BK5me1, H3K4me1, H3K4me2, H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3, H3K27me1, H3K27me2, H3K27me3, H3K36me3, H3K79me1, H3R2me1, R2me2, H4K20me1, H4K20me3 y H4R3me2 en los exones y H3K36me1 en los intrones. Existe evidencia de que la maquinaria epigenética puede contribuir incluso en la selección de un transcrito sobre otro, lo que puede afectar a su vez al funcionamiento normal de la célula. Evidentemente, es necesario proporcionar más datos experimentales sobre el papel de la cromatina en el proceso del ayuste alternativo para establecer los mecanismos implicados. La transcripción controla todos los procesos celulares, incluyendo la proliferación celular y a su vez es in?uenciada directamente por ellos. Los desajustes en la transcripción pueden dar lugar a alteraciones en el ciclo celular. Este posee cuatro fases: G1, S, G2 y M. La duración del ciclo y de sus fases no es uniforme. En las células que se reemplazan rápidamente es más corto que en las de recambio más lento. Incluso algunas células pueden dejar de dividirse por senescencia o por entrar en un estado de quiescencia celular, etapa llamada G0. Mientras que la senescencia es un evento irreversible, las células quiescentes conservan la capacidad de retornar al ciclo celular tras la recepción de señales adecuadas desde el entorno celular. Es lo que ocurre, por ejemplo, en el hígado. La mayoría de sus células son quiescentes, pero el ciclo celular se activa rápidamente tras una hepatectomía parcial, que provoca la regeneración hepática. Este modelo de regeneración es de gran interés en el estudio in vivo de la señalización durante el ciclo celular y en el de los genes inmediatos-tempranos implicados en este proceso. Junto con otros, un gen inmediato-temprano es EGR1. Pertenece a una familia de genes que se activan, rápida pero transitoriamente, por una amplia variedad de estímulos extracelulares, como mitógenos. Codi?ca la proteína EGR1, que actúa como un factor de transcripción. EGR1 contiene un dominio de unión a DNA altamente conservado compuesto por tres dedos de zinc que se unen a la secuencia de consenso GCG(G/T)GGGCG. En trabajos anteriores en el laboratorio, usando la línea celular progenitora de hepatocitos de ratón MLP29, activada con TPA, se ha mostrado que la transcripción de Egr1 se inicia a los 5 min de la inducción y vuelve a los valores basales 180 min después de la adición de TPA. El máximo de transcripción se da a los 30 min de la adición de TPA. El promotor de Egr1 contiene un sitio similar al ETS (ELK1), elementos de respuesta al suero (SRE), de respuesta a cAMP (CRE), de unión al propio producto EGR1 (EBS) y dos elementos para SP1 (Fig. 1.13). EGR1 se une principalmente en el sitio -593 y, por el reclutamiento de NAB1/2 contribuye a la represión posterior de la transcripción. También se ha estudiado el curso temporal de unión de todos estos factores. Algunos estudios han mostrado que el sitio EBS se encuentra en el promotor de genes implicados en el crecimiento celular y en la progresión del cáncer, por lo que el estudio del gen EGR1 es interesante en el campo de la oncología. El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo, con una incidencia superior a 1,36 millones cada año, que aumenta rápidamente en varias áreas históricamente de bajo riesgo, incluyendo España. Se cree que tales tendencias desfavorables re?ejan una combinación de factores que incluyen cambios en los hábitos alimentarios, obesidad y un mayor la prevalencia del consumo de tabaco. Menos del 10% de los casos de CCR se explican por la herencia. Para los casos esporádicos de CCR, como para otros tipos de cáncer, las tres causas principales en su desarrollo son la inestabilidad cromosómica (CIN), la inestabilidad de microsatélites (MSI) y la metilación de las islas CpG, que causa el silenciamiento de genes. Estos tres procesos no son mutuamente exclusivos y pueden ocurrir juntos en ciertos casos. En los con CIN se da un conjunto característico de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores. No está claro si CIN crea un entorno apropiado para la acumulación de estas mutaciones o viceversa. Los genes ordinariamente mutados en pacientes con CCR con CIN son APC, PT53 y KRAS. Asimismo, en CCR hay unas vías especí?cas de señalización implicadas en su desarrollo, entre las que se encuentran la ruta de Wnt, alterada por una o más mutaciones en el 93% de los pacientes, o la ruta RTK/RAS/PI3K que se altera en más del 80% de los pacientes. Las mutaciones en el oncogén KRAS se observan en el 60% a 95% de los focos de criptas aberrantes no-displásicos o hiperplásicos, dando lugar a la activación constitutiva de la ruta de señalización. Las mutaciones de TP53 se presentan en 50% -75% de los CCRs. Otros eventos, como la sobreexpresión aberrante de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) (43% de los adenomas y 86% de los carcinomas) y la pérdida alélica en el cromosoma 18q (70% de CCR primario) también participan en el proceso de tumorigénesis. La gran cantidad de información ha aumentado la comprensión de la enfermedad y todos los genes mencionados anteriormente son potenciales marcadores moleculares para el diagnóstico, el pronóstico y la terapia dirigida, pero queda mucho trabajo pendiente en este campo. Los tratamientos tradicionales para el CCR son la cirugía, la ablación y la radiación (estadio II, III, IV), la quimioterapia (estadio II, III, IV) y la terapia dirigida (estadio IV y recidivante). La quimioterapia utiliza medicamentos para interrumpir el crecimiento de células cancerosas, o evitar su multiplicación. La terapia dirigida incluye anticuerpos monoclonales e inhibidores de la angiogénesis, que atacan de forma especí?cas a las células cancerosas sin dañar a las normales. En la práctica clínica, la terapia dirigida más utilizada es la que incluye anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En condiciones homeostáticas, la activación del receptor está regulada por la disponibilidad de ligandos, que forman colectivamente la familia del factor de crecimiento EGF. La activación del EGFR estimula una señalización intracelular compleja, cuyas principales rutas son las de RAS/RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT y PLC /PKC. La desregulación de la actividad de EGFR se ha relacionado con el desarrollo, la progresión y la diseminación metastásica. Por eso, se han concentrado esfuerzos en el desarrollo de inhibidores que se dirigen efectivamente a EGFR, debido a que la sobreexpresión, el aumento de la actividad o la presencia de mutaciones en EGFR puede ser un factor causal en la etiología de cánceres epiteliales humanos. Se emplean actualmente dos anticuerpos monoclonales, el cetuximab aprobado en 2004 por la FDA y el panitumumab, aprobado en 2006. Cetuximab es un anticuerpo monoclonal, que bloquea directamente la unión del ligando al EGFR, y limita la activación de varias vías de transducción de señal. Panitumumab es un anticuerpo monoclonal totalmente humano que se une al dominio extracelular de EGFR con una alta a?nidad y bloquea la unión de ligandos. Asimismo, inhibe la activación de las células de los tumores dependientes de EGF, la fosforilación de la tirosina de EGFR, y la proliferación. También se emplea en terapia dirigida, incluso en pacientes con CCR metastásico (CCRm) el regorafenib, un inhibidor de la actividad proteína quinasa de muchas enzimas. La combinación de terapias dirigidas a pacientes con metástasis hepáticas que poseen KRAS de tipo salvaje ha ampliado la tasa de respuesta antitumoral hasta más del 70%. Sin embargo, la terapia dirigida no es e?caz en todos los pacientes y el pronóstico para los pacientes CCR metastásico sigue siendo pobre. Muchos estudios muestran que el tratamiento en los pacientes portadores de mutaciones en el gen KRAS no resulta bene?cioso, y la supervivencia tras el tratamiento con anticuerpos anti-EGFR solos o en combinación con quimioterapia es baja. Por lo tanto, es evidente la necesidad de obtener nuevas dianas para la terapia contra la CCR. Los mecanismos epigenéticos juegan un papel esencial el desarrollo y progresión del cáncer y su desregulación puede provocar la expresión aberrante de patrones que dan origen a todas las características típicas de cáncer. En la actualidad ya existe una primera generación de terapias epigenética que incluyen fármacos dirigidos contra las DNA metiltransferasas, las desacetilasas de histonas y la quinasa Janus 2 (JAK2). Sin embargo, estas terapias alteran de forma no totalmente especí?cas los patrones epigenéticos y pueden tener efectos secundarios no deseados. Se están desarrollando nuevas terapias epigenéticas, en fase preclínica y clínica, que incluyen inhibidores de la enzima poli-ADP ribosa polimerasa (PARP), de histona desmetilasas, de histona acetiltransferasas, etc. A pesar de estos avances prometedores, todavía hay muchas cuestiones sin respuesta. Por ejemplo, sería deseable encontrar los mecanismos que permitan una regulación epigenética especí?cas de genes, o de sus isoformas. También es interesante saber cómo una sola mutación en un oncogén, como es el caso del KRAS, puede in?uir en la respuesta al tratamiento del cáncer y cómo puede estar involucrada la maquinaria epigenética. El gen KRAS es, junto con NRAS y HRAS miembro de la familia Ras. Está localizado en el brazo corto del cromosoma 12 en la posición 12,1 (Chr12: 25358180- 25403870, GRCh37) y codi?ca una proteína de 21 kDa, que pertenece a la superfamilia de GTPasas pequeñas. Da lugar a dos proteínas muy estudiadas, KRAS 4A y KRAS 4B. Las mutaciones en KRAS representan el 86% de las mutaciones RAS que se encuentran en CCR con una incidencia de aproximadamente el 15% en todos los tumores humanos y de 30 a 50% en el CCR. Las mutaciones en los codones 12 y 13 dan cuenta de la mayoría de las mutaciones activadoras, y hay también algunas mutaciones menos comunes en el los codones 61, 63 y 146 (<5% de las mutaciones totales en KRAS). Estas mutaciones de limitan el uso de terapias anti-EGFR ya que hacen constitutivamente activa la ruta de señalización con independencia de la unión de ligando al receptor. Aunque estudios recientes han demostrado que las diferentes mutaciones en KRAS, tienen diferentes repercusiones en las rutas de señalización y en la respuesta al tratamiento de CCR, quedan por resolver muchas cuestiones relativas a las últimas consecuencias de la alteración de las vías de señalización. Por otra parte, también es de destacar que, aunque las mutaciones que afectan al gen KRAS están bien caracterizadas, la epigenética de este gen no está bien estudiada. En los últimos años se han desarrollado nuevas tecnologías y herramientas bioinformáticas para el análisis de la expresión génica. En el año 2006 se desarrolló una técnica de segunda generación para secuenciar todo el transcriptoma, la secuenciación masiva en paralelo de ARN (RNAseq) en forma de cDNA. Con RNAseq no sólo es posible comparar los niveles de transcripción en diferentes condiciones, sino también conocer la secuencia del transcrito de cDNA. Este fue un paso importante en el estudio a gran escala del ayuste alternativo, lo que permitió el descubrimiento de nuevas isoformas y su cuanti?cación. Todos estos resultados han proporcionado información valiosa en el estudio de la ocurrencia del ayuste alternativo en células de cáncer. En 2010 Trapnell et al. pusieron a disposición de la comunidad cientí?ca un protocolo de análisis de RNAseq. Este protocolo consiste en la utilización del Software Bowtie para indexar el genoma de referencia; el software TopHat, para alinear las secuencias en el genoma de referencia; el software Cu?inks para estimar la abundancia de cada transcrito en una muestra; el software Cu?merge para tener una referencia de coordenadas de su posición en el genoma de las lecturas de dos o más muestras; el software Cu?di? para comparar la abundancia de genes e isoformas entre dos o más muestras. El análisis RNAseq permite estudiar las diferencias entre el transcriptoma de dos o más condiciones celulares debidas, por ejemplo, a una única mutación. De esta manera se puede establecer una relación entre la presencia de la mutación y los cambios en la expresión de genes que directa o indirectamente están siendo afectados. El poder de estas nuevas estrategias de estudio permite dilucidar los mecanismos por los que una sola mutación, en sinergia con otras, puede alterar la regulación celular. De esta manera, las herramientas bioinformáticas proporcionan un método valioso para identi?car, mediante un análisis in silico, nuevas dianas terapéuticas a la vez que permiten predecir los posibles efectos in vitro. El presente trabajo estudia los mecanismos de regulación de la expresión génica a nivel mononucleosomal. Dos aspectos de estos mecanismos fueron analizados especí?camente. En primer lugar, los cambios que ocurren en el promotor, ya que tienen una importancia decisiva para la iniciación de la transcripción. En segundo lugar, los mecanismos implicados en la regulación del ayuste alternativo, que, a su vez, implica en muchos casos el escape de RNA polimerasa a partir de un complejo de pausa, y el acoplamiento entre la procesividad de la RNA polimerasa y el ayuste. Para lo anterior se desarrollaron los siguientes objetivos generales: 1) Estudiar los cambios en la cromatina que se producen en el promotor de un gen mediante la aplicación de una metodología para el estudio del posicionamiento y las modi?caciones epigenéticas a nivel mononucleosomal. 2) Estudiar el posicionamiento y las modi?caciones epigenéticas en los genes con eventos de ayuste alternativo alterados en las líneas celulares de CCR en función del estado mutacional del gen KRAS. 3) Estudiar el posicionamiento y las modi?caciones epigenética en la región de ayuste alternativo del gen KRAS en líneas celulares de CCR. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Posicionamiento y modi?caciones de histonas en el promotor del gen Egr1: En los resultados previos obtenidos en el laboratorio, se estableció el ciclo de activación /represión del gen Egr1, mediante el tratamiento con TPA en la línea celular MLP29 y se caracterizaron los elementos de su promotor. Por lo tanto, Egr1 ofrece un modelo práctico para estudiar los cambios en la estructura y la epigenética de la cromatina que ocurren en un promotor, tanto en la fase de activación como de represión en el proceso de expresión transitoria del gen. Se determinó en primer lugar las posiciones de los nucleosomas en el promotor y en la región proximal de la transcripción del gen Egr1 por medio de un ensayo de protección a MNasa en la región de -800 a 400 en relación con TSS. Como se muestra en la Fig.4.1 A, los resultados indican la presencia de tres áreas protegidas, dos en el promotor y la tercera al principio de la región codi?cante. Estas regiones son de tamaño compatibles con la presencia de nucleosomas, por lo que se le denominan como nucleosomas -2 (N-2), -1 (N-1) y +1 (N+1). La posición de los nucleosomas en el área de estudio coincide en términos generales con la probabilidad de localización de nucleosomas hecha por el programa NuPoP (Fig. 4.2 A). Una vez que la posición de los nucleosomas en el estado basal del gen (tiempo 0) fue establecida, la investigación se continuo´ con el estudio de la dinámica nucleosomal en el ciclo de la activación/represión de Egr1. Los resultados muestran la presencia de cambios claros en la ocupación nucleosomal que se producen en paralelo al de la transcripción. Los nucleosomas N-1 y N+1 disminuyen la protección frente a la digestión con MNasa cuando el gen se activa, mientras que en el nucleosoma N-2 se observa un deslizamiento aguas abajo (Fig. 4.1). Estos cambios son apreciables ya desde los 5 min después de la adición de TPA a las células MLP29 y alcanza su máximo a los 30 min, mientras que a los 180 min los nucleosomas vuelven a su estado basal. Para conocer si el deslizamiento del nucleosoma -2 y el desalojo parcial de los nucleosomas -1 y +1 es una peculiaridad de las células MLP29, o constituye una forma general de activación a un nivel de la cromatina para Egr1, se hicieron ensayos similares de protección a nucleasa durante la regeneración hepática tras hepatectomía parcial. Primero se estudia el ciclo de activación del gen Egr1 en el modelo in vivo mediante qRT-PCR. Los resultados indican que el gen se transcribe ya a los 30min después de la hepatectomía parcial, observándose un pico de acumulación de mRNA a las 3 horas para los tiempos estudiados. Por último, la expresión de Egr1 decayó y volvió al nivel basal a las 24 h. Suponiendo que la tasa de recambio de mRNA es comparable en ambos sistemas experimentales, el máximo de la tasa de transcripción en la regeneración hepática podría tener lugar a 1,75 h después de la hepatectomía parcial (ver Fig. 4.3). El ensayo de protección frente a la digestión con MNasa a 1,75 h y a 24 h después de la hepatectomía parcial, comparado con los animales con operación simulada, mostró que ambos modelos biológicos se comportan de una manera similar (Fig. 4.4). Como ocurre en las células MLP29 después de 30 min del tratamiento con TPA (Fig. 4.1 d), en el modelo in vivo el nucleosoma N-2 se desliza aguas abajo después de 1,75 h de hepatectomía parcial. Los nucleosomas N-1 y N+1 disminuyen su protección, aunque el nucleosoma N+1 se encuentra mejor posicionado que en el modelo in vitro y se desplaza aguas abajo como ocurre con N-2 (Fig. 4.4 A). Finalmente, a las 24 h después de la hepatectomía parcial, el per?l de protección frente a la MNasa vuelve a su estado basal al igual que lo hace la expresión del gen (Fig. 4.4 B). Por lo anterior se puede a?rmar que los cambios observados en los nucleosomas no se deben a una peculiaridad del modelo. Por otra parte, es posible que el deslizamiento del nucleosoma -2 se requiere para que la proteína EGR1 pueda unirse a su sitio en -595, lo que a su vez, podría conducir a la represión del gen después de reclutar NAB1 y NAB2. Por lo que, para determinar si la presencia de la proteína EGR1, que se observa en los ensayos ChIP de alta resolución, es de alguna manera la causa el deslizamiento de nucleosoma -2, se realizaron ensayos de silenciamiento génico con siRNAs. Los resultados muestran que los siRNAs de Egr1 disminuyen los niveles de mRNA hasta un 43% en 15 min, a 31% en 30 min y 15, 4% a los 60 min después de tratamiento con TPA cuando se compara con el siRNA inespecí?co (Fig. 4.5 B). Además, la proteína EGR1 es indetectable en Western blot tras el tratamiento con siRNA Egr1-2 a los distintos tiempos de activación del gen (Fig. 4.5 C). El estudio de la ocupación nucleosomal tras el silenciamiento de Egr1 en las células MLP29, muestra que en las células transfectadas con Egr1 siRNA-2, el deslizamiento aguas abajo del nucleosoma -2 es más notable y más duradero que en las células MLP29 transfectadas con el siRNA control y a los 60 min permanece en la misma posición que a los 30 min (Fig. 4.6 A). Por otra parte, los cambios temporales en el nucleosoma -1 (Fig. 4.6 B) no se ven afectados después del tratamiento con siRNA Egr1, es decir, a los 30 min después del tratamiento con TPA el nivel de protección contra MNasa decae y vuelve a los valores basales, a los 60 min. Los presentes resultados sugieren que EGR1 está involucrada en la represión del gen Egr1. Este hecho está de acuerdo con datos previos que indican que EGR1, NAB1 y NAB2, permanecen unidos al promotor de Egr1. Finalmente, se estudian las modi?caciones en histonas de nucleosomas individuales (mediante Nu-ChIP) en el promotor y al inicio de la región transcribible, durante el ciclo de activación/represión del gen Egr1 en las células MLP29. El análisis de las marcas epigenéticas incompatibles, tales como acetilación y metilación del mismo residuo de lisina, dio resultados opuestos, los que puede ser considerado como un control interno de la ?abilidad de los métodos utilizados. El nivel de la modi?cación H3S10phK14ac, que constituye un doble sello característico de genes inmediatos-tempranos, alcanza en el gen Egr1 un nivel máximo 15 min después del tratamiento con TPA, y vuelve al nivel basal a los 30 min. Por otra parte, esta modi?cación se produce preferentemente en el nucleosoma +1. Esta modi?cación rápida y transitoria precede a otras modi?caciones y a la transcripción en sí, que llega a un máximo a los 30 min de la inducción. Estos datos sugieren que la fosfoacetilación de H3 en el N+1 es decisiva para un reclutamiento productivo de la RNA polimerasa, pero no es necesaria para el mantenimiento de la transcripción. La marca H3K14ac, reconocida inicialmente como una modi?cación de histona activadora, se encuentra intensa en todos los nucleosomas estudiados a los 15 min después de la estimulación con TPA, especialmente en nucleosomas -1 y +1 (Fig. 4.7 B). Parece claro que, después de 15 min de tratamiento, el curso temporal de la variación H3S10phK14ac en nucleosoma +1 es paralela a la de H3K14ac. En ese nucleosoma, tanto H3S10phK14ac como H3K14ac regresan a su valor basal a los 30 minutos después de la adición de TPA. Por otra parte, las modi?caciones H3K4me3 (Fig. 4.7 D), H3K9me3 (Fig. 4.7 E) y H3K27me3 (Fig. 4.7 G), son especí?cas del nucleosoma +1 en mayor o menor grado. La marca epigenética H3K9me3 ha sido descrita como característica de la heterocromatina, es capaz de reclutar HP1, que participa en la formación de heterocromatina y, en consecuencia, en el silenciamiento de genes. Puede parecer extraño que esta marca epigenética puede encontrarse en el N+1, especialmente entre 15 y 60 min después de TPA adición (Fig. 4.7 E), cuando la tasa de transcripción es más alta. El estudio por Nu-ChIP (Fig. 4.7 I) de la presencia de HP1 en el promotor mostró que su presencia era paralela a la modi?cación de H3, y estaba presente en N+1, en particular, a los 15 min después de la adición de TPA. Estos resultados están de acuerdo con los datos de algunos autores que encuentran que la presencia de H3K9me3 y de HP1 está asociada con la elongación de la transcripción. Los cambios en H3K27me3 siguen un patrón similar al de H3K9me3. Los nucleosomas -2 Y -1 están apenas metilados, aunque el N+1 es claramente modi?cado, con un máximo a los 30-60 min después de la adición de TPA. H3K27me3 se ha descrito clásicamente como una marca de represión, y los resultados muestran que la “marca bivalente activadora/represora de H3K4me3 y H3K27me3” se asocian preferencialmente con el mismo nucleosoma (Fig. 4.7 D y G). No es posible saber si lo hacen en la misma cola de histonas, o si son el resultado aditivo de dos eventos diferentes, la H3K4me3 para el recambio de la histona, y la H3K27me3, que inhibe la elongación por la ARN pol II, relacionado con la disminución de la tasa de transcripción de 30 min en adelante. Como era de esperar, el patrón acetilación de H3K27 (Fig. 4.7 F) y H3K9 (Fig. 4.7 H) es opuesta al de metilación de los mismos residuos y los nucleosomas más fuertemente acetilados, es decir, los localizados en el promotor están apenas metilados y viceversa. Las modi?caciones H4K16ac y H3K9ac son especialmente intensas en el nucleosoma -1. Los resultados obtenidos permiten el diseño de un modelo de cambios estructurales y de modi?caciones de histona durante la activación y la represión del gen Egr1 (Fig. 4.8). Las ventajas de llevar a cabo estos estudios a resolución mononucleosomal son importantes para la remodelación de la cromatina y la adquisición de marcas activadoras o represoras, ya que estas pueden actuar de manera distinta y especí?cas de nucleosoma. El objetivo ?nal de un estudio epigenética debe ser el establecimiento de relaciones causales entre las modi?caciones epigenéticas y sus efectos aguas abajo del gen, pero es necesario realizar investigación adicional para establecer estas conexiones. Una vez que se has establecido las condiciones para estudiar los cambios en la estructura de la cromatina y en las marcas epigenéticas a una resolución mononucleosomal en el modelo murino del gen Egr1, la investigación se dirigió´ al estudio de la in?uencia de la estructura de la cromatina y modi?caciones epigenéticos en el ayuste alternativo de genes potencialmente implicados en la resistencia a los fármacos anti-EGFR asociada a la mutación G13D en el gen KRAS en el CCR. Selección de un gen candidato para el estudio de la estructura y función de la cromatina en el ayuste: Este trabajo corresponde a la primera parte del segundo objetivo de la presente tesis. En el que mediante estudios de RNAseq se seleccionan genes candidatos que poseen isoformas producidas por ayuste alternativo y diferencialmente expresadas en relación a la mutación G13D en el oncogén KRAS. Para ello, ocho conjuntos de datos de RNAseq, que corresponden al transcriptoma de las líneas celulares RKO, SW48, Caco2 (dos juegos), HCT116 (tres conjuntos) y DLD1, fueron descargados desde la base de datos de SRA. La línea celular SW48 es de tipo salvaje en los cuatro oncogenes descritos y por lo tanto se utiliza como control en las comparaciones. Las líneas celulares DLD1 y HCT116 comparten la misma mutación KRAS G13D, pero DLD1 alberga diferentes mutaciones en PIK3CA y TP53 mientras HCT116 es de tipo salvaje en el último gen. La línea celular RKO comparte la mutación PIK3CA con HCT116, pero RKO poseen una mutación en BRAF. La línea celular Caco2 alberga una mutación en TP53 (ver Tabla 4.2). Tras la aplicación de los paquetes informáticos descritos en materiales y métodos, se obtiene una lista ?nal de isoformas diferencialmente expresadas en relación a la presencia de la mutación KRAS G13D (Tabla 4.3). Estas isoformas pertenecen a los genes ENO1, RPL13, ZNF518B, EPDR1 y HSP90B1, y sus valores de expresión in silico expresados en FPKM, se muestra en la Fig. 4.12. Los resultados obtenidos en el análisis in silico se veri?caron experimentalmente por RT-qPCR. De los genes encontrados tras el análisis de spliceR, se han seleccionado EPDR1 y ZNF518B para continuar el análisis experimental, por dos razones principales: por un lado, los resultados experimentales están en excelente acuerdo con los del análisis in silico, en el que existe una signi?cativa expresión diferencial de las isoformas cuando las líneas que llevan la mutación KRAS G13D, en concreto HCT116 y DLD1, se comparan con las líneas celulares KRAS salvaje; Por otro lado los resultados sugieren que la transcripción de estos genes esta activada por la mutación en KRAS. En los genes RPL13, ENO1 o HSP90B1, o bien los datos in silico fueron poco concordantes con los experimentales, o bien no es posible diseñar oligonucleótidos para ampli?car regiones únicas en las diferentes isoformas para estudiarlas separadamente. Para continuar el estudio, se utilizan las líneas celulares derivadas de HCT116 (HAE6 y HAF1) y las derivadas de DLD1 (D-Mut1 y DWT7). En el caso del gen ZNF518B, cuando se observan los resultados de expresión obtenidos en la las líneas celulares DLD1 y sus isogenicas, parece existir una clara relación entre el estado mutacional del gen KRAS y los niveles de expresión de este y de sus isoformas. En relación con la expresión particular de las isoformas, las isoformas 326756, 507515 y 503068 dan cuenta para la mayoría de las transcripciones (Fig. 4.20, B, C y E), mientras que las isoformas 515072 y 500268 corresponden a una pequeña minoría de las transcripciones del gen (Fig. 4.20 D y F). De entre los dos genes mencionados, se ha elegido el gen ZNF518B para el estudio en profundidad del posicionamiento de nucleosomas y las marcas epigenéticas en las regiones de ayuste alternativo del mismo. Los datos publicados hasta el momento sobre el mismo son particularmente escasos. ZNF518B se ha descrito como un marcador potencial de la gota y un estudio proteómico reciente describió que la proteína regula los niveles de H3K9me2, debido a su interacción con complejos de histona metiltransferasa. Este hecho es particularmente interesante en vista de los objetivos ?nales a los que el trabajo del laboratorio esta´ dirigido. El hecho de que la función de la proteína aún no se entienda completamente añade otro punto interesante para su estudio, ya que tiene potencial para ser propuesto como una nueva diana para las terapias antitumorales en CCR. Posicionamientos y modi?caciones en el evento de poliadenilación alternativa en el gen ZNF518B: El gen ZNF518B, da lugar a cinco transcritos, aunque solo dos de ellos codi?can proteínas. El trascrito que se denomina T1, codi?ca una proteína con dedos de zinc de 1074 aminoácidos. El transcrito denominado como T2 es el resultado de múltiples eventos de omisión/inclusión de exón y de una terminación alternativa. También es supuestamente traducido, lo que daría lugar a una proteína corta que contiene los primeros 75 residuos. Nada se sabe acerca de su presencia en las células y de su posible papel. La Fig. 4.21 muestra el mapa del gen, la estructura de las isoformas de T1 y T2, así como la localización de las proteínas codi?cadas. El análisis del ratio de expresión de la isoforma T2 frente a T1 de ZNF518B muestra diferencias entre las líneas celulares DLD1 (G13D/+) y D-Mut1 (G13D/-), lo que se correlaciona con el estado mutacional de KRAS, cuando se compara con la línea celular control SW48. La región seleccionada para el estudio de la estructura de la cromatina en las isoformas del gen ZNF518B, cubre la región de la frontera intrón-exón 4 que está implicada en uno de los eventos de ayuste alternativo que da lugar a los transcritos T1 y T2. Mediante el uso del mismo enfoque experimental empleado para estudiar el promotor de gen murino Egr1, se estudió la ocupación nucleosoma en esa región y se seleccionaron los amplicones para analizar las marcas epigenéticas por Nu-ChIP. Los resultados de ensayos de protección a MNasa en la región de estudio de 800 pb (Fig. 4.23), señalan que los nucleosomas no están tan posicionados si se compara con el promotor de Egr1 (Fig. 4.1 A). Esto está de acuerdo con la predicción realizada por el programa NuPop (Fig. 4.24), en el que no se tiene un claro patrón de probabilidad para comenzar los nucleosomas y las mesetas de ocupación nucleosomal son cortas o demasiado bajas para obtener a los nucleosomas claramente posicionados. La protección frente a MNasa muestra un per?l desigual (Fig. 4.23), en el que se pueden observar tres picos de posicionamiento nucleosomal. Uno de los picos observados se encuentra cerca del extremo 5’ terminal del exón 4 (N1), y otro pico se observa en la región donde se produce la terminación alternativa de la T2 (N3). Ni la posición de los picos ni su intensidad cambia signi?cativamente en las células DLD1 al comparar los datos con D-Mut1, a pesar de la diferencias en el empalme y terminación en estas líneas celulares. En cambio, al comparar los per?les de protección con la línea celular SW48 que no expresa el gen ZNF518B, se observan cambios. Por lo tanto, los eventos de ayuste alternativo en el procesamiento diferencial de los mRNA entre ambas líneas celulares, puede estar relacionados con causas epigenéticas y no con causas estructurales profundas. Por esta razón, algunas marcas epigenética relevantes en las histonas fueron analizadas en los nucleosomas presentes en la región de estudio en el gen ZNF518B. Se puede observar que el nivel de las modi?caciones H3K36me3, H4K20me1, H3K27ac y H3K9ac, estudiadas en la región seleccionada, es muy baja en la línea celular SW48 en comparación con la de las otras dos líneas celulares: DLD1 y D-Mut1. Lo que sin duda puede estar relacionado con la ausencia de expresión del gen ZNF518B en la línea celular SW48. Por su parte, la distribución de la marca H3K36me3 es homogénea a lo largo de la región de estudio en la línea celular DLD1, lo que esta´ de acuerdo con los datos de que H3K36me3 se enriquece en los exones de los genes humanos activos. Así mismo, la cromatina de la línea celular D-Mut1 está más enriquecida en la marca H3K36me3 en la región en estudio, sobre todo en los nucleosomas N1 y N3 (Fig. 4.25). Por otra parte, la isoforma T2, que se caracteriza por la prematura terminación y por eventos MESI, en la región cubierta por N3 y N1 respectivamente, es más abundantes en la línea D-Mut1 (Fig. 4.22). Estos hechos pueden explicarse si algún factor no identi?cado es reclutado por esta marca epigenética y participa en la prematura terminación de la isoforma T2. Organización de la cromatina y marcas epigenéticas en los sitios de ayuste alternativo del gen KRAS en CCR: Se ha descrito en la bibliografía que el gen KRAS da lugar a dos isoformas, conocidas como 4A y 4B. En realidad la situación es más compleja. Según los datos de Ensembl, el gen posee 7 exones y puede dar lugar a un total de 4 isoformas. En el presente trabajo se denominan T1 (correspondiente a 4B), T2 (4A), T3 y T4 (Fig. 4.26). Se sabe que la forma T2 es apoptótica, mientras que T1 es anti-apoptótica. Las isoformas T3 y T4 pueden dar lugar a proteínas, pero su presencia y posible función se desconocen. Como algunos datos sugieren que la relación T1/T2 puede variar en los mutantes de KRAS, el estudio propuesto en esta sección encaja con los objetivos de la presente tesis. En primer lugar, se determinó en nueve líneas celulares de CCR, el nivel de expresión global del gen y el de las cuatro isoformas individuales. Para ello, se diseñaron oligonucleótidos para el análisis por qPCR (Fig. 4.26). Los resultados del análisis se muestran en la Fig. 4.27, en la que se puede observar que hay una variación en la expresión global del gen entre las diferentes líneas celulares. En cuanto a la expresión de las isoformas, se puede apreciar que T1 es mayoritaria en todas las líneas, pero en nivel de la isoforma T3, no descrita hasta ahora, no es despreciable, e incluso es superior al de T2 en la línea D-Mut1. Para facilitar la selección de las líneas que se van a emplear en el análisis de la cromatina, sirven de ayuda la Fig. 4.27 B y C y la Fig. 4.28. A la vista de los datos contenidos en ellas, se seleccionaron las líneas SW48 y HCT116, ya que muestran gran diferencia en la relación T2/T1, mientras que la proporción de las otras dos isoformas prácticamente no varía. Además, las dos líneas di?eren en el estado mutacional de KRAS. La organización nucleosomal en la región correspondiente a los exones 5, 6 y 7, donde se producen los acontecimientos que dan lugar por ayuste alternativo a las isoformas T1 y T2, se estudió mediante ensayos de protección a MNasa. Los resultados (Fig. 4.29) muestran que en cada uno de los exones 5 y 6 se encuentra bien posicionado un único nucleosoma, que cubre la práctica totalidad del exón. La presencia de nucleosomas en los intrones ?anqueantes está clara en el caso del exón 6 e insinuada en el del exón 5. En cuanto al exón 7, se detecta un nucleosoma en el borde intrón-exón, otro en el intrón aguas arriba y se insinúa otro nucleosoma aguas abajo dentro del exón. Es interesante que la organización nucleosomal es coincidente entre las dos líneas celulares empleadas, a pesar de que el ayuste no es idéntico en ambas. Esto sugiere que la selección del mecanismo de ayuste no se realiza en base a diferencias en la estructura de la cromatina y apunta hacia la conveniencia de investigar si las posibles diferencias de ayuste se deben a causas epigenéticas. El análisis de las modi?caciones epigenéticas se realizó mediante Nu-ChIP en la región cubierta por los nucleosomas exónicos, que se nombran como N-E5, N-E6 y N-E7. Los resultados de este análisis, en el que se han determinado cuantitativamente los niveles de H3K9me3, H3K36me3, H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K27ac y H4K20me1, se recogen en la Fig. 4.30. Se puede observar que, en general, N-E7 es el nucleosoma más densamente marcado. Además, se observan claras diferencias en las marcas entre las dos líneas celulares estudiadas, diferencias que a veces se encuentran en los tres nucleosomas y otras veces, como en el caso de H3K36me3 son patentes solo en uno de ellos. Las acetilaciones estudiadas son más abundantes en la línea HCT116. Puesto que esas modi?caciones facilitan la procesividad de la RNA pol II, los resultados permiten emitir la hipótesis de que el acoplamiento cinético condiciona parcialmente el ayuste. Esto no descarta la posibilidad de que el modelo de reclutamiento sea también parcialmente operativo, como sugiere la distribución de la marca H3K27me3. Finalmente, las marcas H3K9me3 y H3K9ac, que no pueden darse simultáneamente en la misma cola de histona, son abundantes en los tres nucleosomas de HCT116. No se puede decidir con los datos presentes si ambas marcas se encuentran en copias distintas de la histona en el mismo nucleosoma o si cada una es característica de uno de los alelos de esa línea celular heterocigótica para KRAS. La ausencia de esta modi?cación en los nucleosomas de SW48, en la cual ambos alelos del gen son salvajes, apuntaría levemente hacia la segunda posibilidad. Conclusiones: En la presente tesis, se ha empleado el modelo del gen Egr1 de ratón para poner a punto un método para estudiar la estructura y modi?caciones epigenéticas de la cromatina a nivel mononucleosomal. El método se ha usado posteriormente para estudiar la implicación de la cromatina en el ayuste alternativo de un gen de potencial interés oncogénico, seleccionado por un análisis in silico, y del gen KRAS. Los resultados experimentales permiten obtener las siguientes conclusiones: 1. En el promotor de Egr1 y región codi?cante proximal se encuentran tres nucleosomas posicionados, tanto en células de la línea MLP29 in vitro como en hígado de ratón in vivo. Estos nucleosomas se designan como N-2, N-1 y N+1. 2. Tanto en los cultivos celulares como en un modelo de hígado en regeneración, la transcripción de Egr1 con lleva un deslizamiento de N-2 hacia 3’ y la pérdida parcial de N-1 y N+1. El cambio de N-2 permite el acceso de EGR1, cuya unión, ?nalmente, da lugar a la represión del gen. Los cambios en los nucleosomas son reversibles y cuando el ciclo de transcripción ?naliza los nucleosomas retornan a su situación basal. 3. Los experimentos de silenciamiento con siRNA sugieren que el factor EGR1 no está implicado en el deslizamiento de N-2, sino más bien en su retorno a la posición basal. 4. Se ha estudiado a nivel mononucleosomal el cambio temporal de ocho modi?caciones de histonas durante el ciclo de activación-represión del gen Egr1. La mayor parte de las modi?caciones muestran variaciones cualitativas o cuantitativas especí?cas de cada nucleosoma y al ?nal del ciclo de transcripción vuelven a su estado basal. 5. La acetilación de H4K16, H3K9 y H3K27 predomina en los nucleosomas del promotor. La trimetilación de H3K4, H3K9 y H3K27 es especí?cas de N+1 en mayor o menor grado. La acetilación de H3K14 es relativamente homogénea en los tres nucleosomas, mientras que la modi?cación H3S10phK14ac está más presente en N+1. 6. Se ha realizado una búsqueda in silico para localizar los genes que dan lugar a procesos de ayuste alternativo dependiente de la mutación G13D de KRAS. El análisis mediante spliceR ha permitido la localización de isoformas pertenecientes a cinco genes. En dos de ellos, EPDR1 y ZNF518B, los resultados se han validado experimentalmente por qPCR en líneas celulares isogénicas derivadas de DLD1. 7. Se ha estudiado mediante ensayos de protección a MNasa la presencia de nucleosomas en la región implicada en la terminación y ayuste alternativos del gen ZNF518B. No se encuentra un posicionamiento estricto de nucleosomas, pero los resultados sugieren que hay una localización parcialmente preferente para tres nucleosomas, uno en el principio del exón 4 y otros dos alrededor del sitio alternativo de poliadenilación. 8. El per?l de resistencia a MNasa es prácticamente idéntico entre las líneas DLD1 y D-Mut1, aunque di?eren en el estado mutacional de KRAS y en la proporción de isoformas de ayuste. No obstante, el per?l es diferente en las células SW48, que no expresan ZNF518B. La organización nucleosomal, por tanto, no in?uye en el ayuste alternativo de este gen. 9. Se ha estudiado la distribución de las marcas H3K36me3, H4K20me1, H3K27ac y H3K9ac en los tres máximos de protección a MNasa. En general, las modi?caciones están más presentes en las líneas DLD1 y D-Mut1, que expresan el gen, que en las células SW48. Para cada una de las modi?caciones, sólo se encuentran mínimas diferencias entre los distintos picos nucleosomales. Por otro lado, los resultados sugieren que la modi?cación H3K27ac podría estar implicada en la poliadenilación alternativa. 10. Se ha estudiado la expresión de KRAS y de sus isoformas en nueve líneas celulares de CCR. Además de las isoformas 4A y 4B, bien descritas en la bibliografía, el análisis se ha extendido a las otras dos isoformas. A la vista de los resultados, se han seleccionado las líneas HCT116 y SW48 para estudios ulteriores sobre organización y modi?caciones epigenética de la cromatina en las regiones críticas para el ayuste alternativo. 11. Los resultados de experimentos de protección a MNasa permiten concluir que hay tres nucleosomas, N-E5, N-E6 y N-E7, bien posicionados sobre los exones implicados en el ayuste alternativo. Entre las líneas HCT116 y SW48 sólo se han encontrado mínimas diferencias. 12. Se ha cuanti?cado, tras experimentos de Nu-ChIP, la presencia de las modi?caciones H3K9me3, H3K36me3, H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K27ac y H4K20me1 en los tres nucleosomas indicados. La distribución de las histonas acetiladas sugiere que el ayuste alternativo puede estar controlado, en parte, por acoplamiento cinético, aunque la abundancia de H3K4me3 en N-E7 parece indicar que participan otros mecanismos en la selección del modo de ayuste.
