Resumen de Metabolismo de clorofilas en frutos del olivo (Olea europaea l.) de las variedades arbequina y hojiblanca. Implicación del endocarpo en el perfil clorofílico del aceite de oliva.
Las clorofilas presentes en un fruto están sometidas tanto a procesos anabólicos como catabólicos que rinden, dependiendo del estado de madurez y variedad de los frutos, un perfil clorofílico muy diferente. Aunque a grandes rasgos la ruta catabólica de clorofilas está descrita, la bibliografía hace referencia a la presencia de ciertos derivados clorofílicos oxidados que no han podido ser ubicados en esta ruta general. La presencia de estos catabolitos oxidados ha puesto de manifiesto la existencia de un metabolismo de clorofilas específicamente oxidativo, siendo las peroxidasas las enzimas más investigadas en relación con este metabolismo. Sin embargo, se desconoce en gran medida el significado que este metabolismo oxidativo de clorofilas puede tener dentro del metabolismo general de dichos pigmentos.
En concreto, hasta el momento no se conocen con exactitud los sistemas enzimáticos responsables de la degradación de las clorofilas que tiene lugar a lo largo de todo el ciclo de vida de las aceitunas, llegándose incluso a apreciar diferencias en el perfil clorofílico en función de la variedad oleícola. Estas diferencias varietales relacionadas con el perfil de pigmentos pueden además verse reflejadas en los respectivos aceites de oliva. Adicionalmente, la composición clorofílica del aceite de oliva virgen depende de otros factores tanto agronómicos (estado de madurez del fruto) como tecnológicos (tratamientos poscosecha, condiciones de almacenamiento, sistemas de extracción, etc).
El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue sentar las bases o fundamentos bioquímicos que regulan el catabolismo de clorofilas en frutos de olivo. Se prestó especial interés en conocer bioquímicamente el origen específico de los derivados clorofílicos oxidados que se acumulan de forma selectiva en diferentes variedades de aceituna y dilucidar el grado de implicación de la ruta catabólica general de clorofilas en el metabolismo de estos frutos. Así mismo se examinó la influencia de distintos factores agronómicos (variedad y el grado de madurez de la aceituna empleada) y tecnológicos (tratamientos térmicos postcosecha y deshuesado del fruto) en las reacciones de degradación de clorofilas que tienen lugar durante la elaboración de aceite de oliva virgen y en la distribución de estos compuestos entre las distintas fases del proceso, prestando especial atención al grado de transferencia hasta la fase oleosa.
El trabajo de investigación descrito en esta Tesis Doctoral ha permitido:
1.- Caracterizar in vitro la actividad peroxidasa oxidante de clorofila (POD-cl) en el extracto solubilizado a partir de precipitado proteínico procedente de la pulpa del fruto del olivo (Olea europaea L), mediante la separación, identificación y cuantificación de los productos de la reacción por técnicas de HPLC-UV/visible, describiéndose por primera vez: - una competencia in vitro en presencia de ácido p-cumárico entre peroxidasa y clorofilasa por el sustrato clorofílico. Esta competencia fue altamente significativa en frutos de la variedad Arbequina, debido a los elevados niveles de actividad clorofilasa (CLASA) propios de esta variedad y fue posible solventarla gracias al efecto inhibidor que sobre la actividad CLASA proporciona la inclusión de 2,4-diclorofenol (DCF) como cosustrato reductor de la reacción enzimática de peroxidasa.
- una formación y degradación enzimática secuencial de derivados clorofílicos oxidados no descritos hasta el momento, producidos por el sistema POD/H2O2 en presencia de DCF. Uno de estos nuevos derivados clorofílicos, identificado de forma preliminar como ¿clorofila a oxidada¿, ha sido encontrado in vivo en frutos de olivo, llegándose a describir su evolución durante todo su ciclo vegetativo de crecimiento y maduración, en las variedades Hojiblanca y Arbequina.
- un efecto de inhibición de la oxidación enzimática del sustrato clorofílico provocado por exceso de concentración de clorofila a o clorofilida a y de los co-sustratos DCF y H2O2, estableciéndose una óptima relación de concentración relativa de los sustratos en [H2O2]/[2,4-DCF]/[Clorofila] = 1:2,:0,01 que demostró ser esencial para una correcta determinación de la velocidad de la reacción al evitar los efectos de inhibición.
- una ausencia de funcionalidad de la actividad POD-cl sobre los derivados clorofílicos sin el ión Mg+2 central del anillo tetrapirrólico (feofitinas y feoforbidas), lo que sugiere el papel fundamental de este ión en el reconocimiento y anclaje del sustrato clorofílico al centro activo de POD.
2.- Estudiar la distribución subcelular de la actividad POD-cl, mediante el empleo de una metodología específica para la obtención de fracciones subcelulares procedentes de pulpa de aceituna mediante técnicas de centrifugación diferencial. Se demostró que la actividad localizada en la fracción enriquecida en membranas tilacoidales en los frutos de la variedad Arbequina era significativamente superior a la de Hojiblanca, representando más del 50% de la actividad total ligada a membranas. Así mismo se comprobó que la evolución de dicha actividad enzimática durante el ciclo de vida del fruto era paralela a la formación y acumulación de derivados oxidados de clorofila, lo que evidenció por tanto una implicación directa de la peroxidasa tilacoidal en el metabolismo específicamente oxidativo de clorofilas.
3.- Establecer una nueva metodología para la cuantificación, en epicarpo de aceitunas, del principal sistema enzimático implicado en la ruta catabólica general de clorofilas, Feoforbida a oxigenasa (PaO)-RCC reductasa (RCCR), lo que ha permitido demostrar que dicha ruta catabólica se encuentra activa en estos frutos. La estimación independiente de estas actividades enzimáticas ha evidenciado que la apertura oxigenolítica de feoforbida a catalizada por PaO es el paso limitante de la reacción global, mostrando en la variedad Hojiblanca un nivel significativamente mayor que en Arbequina. Así mismo, mediante técnicas de HPLC-MS se han caracterizado por primera vez los diferentes catabolitos no coloreados (NCCs) terminales en la ruta catabólica de clorofilas en aceitunas, estableciéndose la secuencia de reacciones que dan lugar a su formación y describiéndose la primera evidencia de una diferenciación varietal en el perfil de estos catabolitos en el reino vegetal.
4.- Caracterizar la fracción clorofílica presente en los aceites, pastas y orujos obtenidos durante el proceso de elaboración del aceite de oliva mediante un sistema de extracción de tres fases a escala de laboratorio (Abencor), determinando los cambios tanto en el perfil de pigmentos clorofílicos, como en la distribución de estos compuestos entre las distintas fases del proceso y el grado de degradación a productos no coloreados. Los resultados evidenciaron un incremento de la tasa de transferencia de pigmentos a la fase oleosa asociado a la variedad Hojiblanca, a los estados de madurez avanzados, al tratamiento térmico de fruto y a la presencia del hueso durante el molturado y el batido de las pastas. Así mismo, no se pudo imputar de forma directa las pérdidas de pigmentación a la carga enzimática peroxidativa presente ni en la pulpa ni en el endocarpo de la aceituna.
