Diseño y caracterizacion de proteinas quimericas para el estudio del reconocimiento molecular entre ligandos peptidicos y dominios sh3
- Autores: Adela Mª Candel Ramon
- Directores de la Tesis: Francisco Conejero Lara (dir. tes.), Jose Cristobal Martínez Herrerías (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2008
- Idioma: español
- ISBN: 9788433847522
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pedro Luis Mateo Alarcón (presid.), Salvador Casares Atienza (secret.), Marta Bruix Bayes (voc.), Ana María Cámara Artigas (voc.), Ana Rosa Viguera (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
De forma general, el trabajo presentado en esta Tesis tenía como objetivo fundamental el diseño de proteínas quiméricas que integraran en una única cadena polipeptídica la secuencia de un dominio SH3 y la de un ligando peptídico y que reprodujeran en su estructura terciaria las interacciones típicas entre los dominios SH3 y sus ligandos ricos en prolina. Este objetivo se consiguió mediante la fusión del permutante circular S19P20s y el decapéptido p41 a través de una secuencia de conexión de tres residuos, obteniéndose una proteína quimérica denominada SPCp41. Se caracterizó su estructura a alta resolución, su estabilidad térmica, la termodinámica de las interacciones intramoleculares SH3: ligando en su seno, así como su mecanismo de plegamiento, utilizando un conjunto de técnicas como la resonancia magnética nuclear (RMN), la calorimetría diferencial de barrido (CDB), el dicroísmo circular (DC) y la espectroscopia de fluorescencia y técnicas cinéticas de flujo detenido.
De forma más detallada el trabajo se resume en:
i) Se clonaron y purificaron un conjunto de proteínas quiméricas mediante la fusión entre el permutante circular S19P20s del dominio Spc-SH3 y la secuencia peptídica del ligando p41 utilizando varias secuencias de conexión cortas. Los estudios se centraron en la proteína quimérica que resultó ser más estable térmicamente, y a la que denominamos SPCp41, la cual se caracterizó mediante calorimetría diferencial de barrido, dicroísmo circular y fluorescencia en comparación con el permutante S19P20s. Estos resultados han sido recogidos en una publicación científica en la revista FEBS Letters.
ii) Para continuar nuestra investigación se determinó la estructura tridimensional a alta resolución de la quimera SPCp41, mediante técnicas de RMN heteronuclear multidimensional, lo que nos ha permitido una mejor interpretación de las magnitudes termodinámicas en los estudios posteriores y ayudará a optimizar las interacciones en el sitio de unión utilizando esta información estructural para futuros procesos de diseño de ligandos. Estos resultados se han publicado en la revista FEBS Letters.
iii) Con el fin de demostrar que es posible utilizar la quimera SPCp41 como una herramienta apropiada para evaluar la energética de la unión entre dominios SH3 y ligandos ricos en prolina, y para elucidar, desde un punto de vista termodinámico, la importancia en la afinidad de unión de cada uno de los esiduos prolina del ligando p41, se sustituyó cada prolina por alanina en la quimera SPCp41 y se caracterizó la estabilidad estructural de la quimera y de estos mutantes mediante fluorescencia y DC. Se llevó a cabo el análisis profundo del desplegamiento térmico de la quimera SPCp41 y los mutantes Pro-Ala mediante CDB, según un modelo de tres estados que nos permitió obtener un juego consistente de parámetros termodinámicos tanto para la estabilidad del permutante como para la interacción intramolecular con el ligando p41. Este análisis se completó con un estudio comparativo de las propiedades estructurales y dinámicas mediante RMN de la quimera SPCp41 y uno de los mutantes. Los resultados de la caracterización termodinámica de la estabilidad estructural de la quimera y los mutantes Pro-Ala han sido objeto de una publicación en la revista Journal of Molecular Biology.
iv) Por último, se caracterizó la cinética de plegamiento de la quimera SPCp41 y sus mutantes Pro-Ala, en comparación con el permutante circular S19P20s para analizar en profundidad su mecanismo de plegamiento.
