Resumen de Aplicaciones de la electroforesis capilar a la determinación de fenotiazinas, quinolonas y triazinas
En las últimas décadas la electroforesis capilar (CE) se ha situado en un lugar destacado en el ámbito de las técnicas analíticas separativas, siendo posible actualmente su acoplamiento a diversos sistemas de detección, lo que ha favorecido el aumento exponencial de su campo de aplicación. La presente memoria se enmarca dentro de una de las líneas del grupo de investigación "Calidad en Química Analítica Alimentaria, Ambiental y Clínica" (grupo FQM-302 del Plan Andaluz de Investigación), cuyo objetivo principal es demostrar la potencialidad de la CE en la resolución de distintos problemas relacionados con el análisis farmacéutico, clínico, alimentario y toxicológico. Se han incorporado diferentes sistemas de detección y se han desarrollado distintas metodologías para mejorar los límites de detección, considerando las limitaciones que presenta la técnica en cuanto a sensibilidad debido al reducido diámetro interno de los capilares, la pequeña cantidad de muestra inyectada y el hecho de que la detección se realiza en el mismo capilar.
La memoria se estructura en tres partes en las que se proponen nuevos métodos analíticos para la determinación de diferentes familias de compuestos, en función de los objetivos de los proyectos de investigación en los que se enmarcan los estudios.
En la primera parte, se proponen diversas metodologías para la determinación de fenotiazinas, englobando 3 capítulos, con objeto de justificar algunos de los objetivos del proyecto "Sistemas automatizados de análisis en medicina: aplicación de quimioluminiscencia y electroforesis capilar en control de calidad de compuestos de interés biomédico y en su monitorización en fluidos biológicos" (Ref.: PI021369, Instituto de Salud Carlos III. Ministerio de Sanidad y Consumo).
Así, en el capítulo 1 se ha desarrollado y validado un método utilizando electroforesis capilar zonal (CZE) para el análisis cuantitativo de tres fenotiazinas: metilsulfato de tiazinamio (TMS), hidrocloruro de promazina (PMH) e hidrocloruro de prometazina (PTH) en preparados farmacéuticos. Los parámetros que afectan a la separación electroforética (pH y concentración del tampón, porcentaje de acetonitrilo, temperatura del capilar y voltaje aplicado) se han estudiado por medio de una optimización multivariante empleando un diseño de experimentos donde el objetivo es obtener la máxima eficacia posible. El método permite la separación de las fenotiazinas estudiadas en 5 min. en condiciones óptimas (tampón 100 mM tris(hidroximetil)-aminometano (TRIS) a pH 8,0 y con un 15% de acetonitrilo). El capilar empleado tenía una longitud de 58,5 cm y estaba termostatizado a una temperatura de 25°C. El voltaje aplicado fue de 30 kV. La detección se llevó a cabo a una longitud de onda de 254 nm. Con la utilización de un patrón interno se consiguieron valores aceptables de precisión (la desviación estándar relativa, DER, fue del 5,3%) y de linealidad. Los límites de detección (LOD) fueron 2,8 µg/mL para TMS y 3,3 µg/mL para PMH y PTH. El método se aplicó satisfactoriamente al análisis de preparados farmacéuticos.
En el capítulo 2 se decidió extender la aplicación de la CZE con detección UV-visible a la determinación de cinco fenotiazinas (metilsulfato de tiazinamio (TMS), promazina (PMH), clorpromazina (CPH), tioridazina (THZ) y prometazina (PTH)), pero en este caso se pretendió la aplicación del método a muestras de orina humana con objeto de plantear la monitorización terapéutica de tales fármacos. Se consiguió una separación óptima en capilar burbuja de 64,5 cm de longitud total × 75 µm de diámetro interno. El tampón de separación consistió en una disolución 150 mM de Tris(hidroximetil)aminometano que contenía un 25% de acetonitrilo a un pH aparente de 8,2. La temperatura de separación fue de 25°C y el voltaje aplicado de 20 kV. Se utilizó hidrocloruro de nafazolina como patrón interno (IS). Para mejorar la sensibilidad, considerando el bajo contenido de los analitos estudiados en muestras de orina, se ha aplicado una metodología de preconcentración on-line denominada inyección de muestra de campo amplificado (field amplified sample injection, FASI), considerando la influencia de los parámetros que afectan a dicha preconcentración (naturaleza del bolo de pre-inyección, composición del disolvente de la muestra, voltaje y tiempo de inyección). Debido a las interacciones significativas entre estos parámetros, en este capítulo proponemos por primera vez la aplicación de una metodología multivariante para llevar a cabo este estudio. Las condiciones óptimas obtenidas consistieron en la inyección de un bolo de agua durante 7s a 50 mbar, la inyección electrocinética se realizó aplicando 6,2 kV durante 40 s a una muestra que contenía 32 µM de H3PO4. Se desarrolló también un procedimiento de extracción en fase sólida (SPE) que junto con la preconcentración on-line, permitiese obtener unos límites de detección y una selectividad adecuados para conseguir la determinación en muestras de orina. La combinación de SPE y FASI-CE-UV permitió obtener una linealidad adecuada, así como bajos límites de detección (desde 2 ng/mL hasta 5 ng/mL) y una precisión satisfactoria (DER entre 3,0-7,2 %) con niveles de recuperación válidos para demostrar la utilidad del método en este tipo de muestra.
Finalmente en el capítulo 3 se pretende demostrar la posibilidad del acoplamiento de la detección quimioluminiscente (CL) en CE. Considerando que no existe ningún equipo comercial que incorpore esta detección, en este capítulo se propone el diseño y montaje de un equipo de CE con detección CL para determinar conjuntamente PTH y PMH en muestras reales. Se observó un importante aumento de la emisión CL del luminol en su reacción con ferricianuro potásico en presencia de estas fenotiazinas, así que este sistema fue seleccionado para la detección de estos compuestos tras la separación electroforética previa. Los parámetros que afectan a la separación electroforética se optimizaron de manera univariante, mientras que aquellos que afectan a la detección CL se optimizaron de manera multivariante empleando el diseño de experimentos. También se llevó a cabo un estudio de la robustez de los factores que influyen en la detección CL. El método permite la separación de las fenotiazinas en menos de 4 min., logrando límites de detección de 80 ng/mL para PMH y 334 ng/mL para PTH si se utilizaba la inyección por gravedad. Con objeto de obtener menores límites de detección y así poder determinar estos compuestos en muestras biológicas se empleó la inyección electrocinética. La aplicabilidad del método de CE-CL se ha demostrado mediante la determinación de PTH en preparados farmacéuticos y de PMH en muestras de orina. En este último caso se empleo la inyección electrocinética y el procedimiento de SPE descrito en el capítulo anterior, consiguiendo límites de detección de 1 ng/mL con recuperaciones superiores al 85%.
La segunda parte de la tesis, que incluye los capítulos 4 y 5, aborda un nuevo problema analítico mediante CE: la detección de residuos de antibióticos, concretamente de quinolonas, en alimentos de origen animal. Estos estudios se enmarcan en los proyectos "Implantación de nuevas estrategias analíticas, bajo criterios de calidad, para la determinación de residuos de fármacos y presencia de organismos genéticamente modificados (OGMs) en leche, derivados lácteos y otros alimentos" (Ref.: CAL03-096-C2-2, en colaboración con Puleva Biotech) y "Criterios de calidad en el control analítico de contaminantes en alimentos grasos de origen animal: aplicación a la detectores de masas, de fluorescencia inducida por láser y quimioluminiscentes a técnicas cromatográficas y de electroforesis capilar" (Ref.: CAL03-087-C2-1, en colaboración con el grupo FQM-170 de la Universidad de Almería), ambos financiados por el Instituto Nacional de Investigación Tecnológica Agraria y Alimentaria, INIA, MCyT).
Así, en el capítulo 4 se ha propuesto y validado un método analítico basado en CZE con detección por espectrometría de masas en tándem (CZE-MS/MS) para la identificación y cuantificación simultáneas de ocho quinolonas de uso veterinario en leche cruda de vaca. Las quinolonas estudiadas son danafloxacina (DAN), sarafloxacina (SAR), ciprofloxacina (CP), marbofloxacina (MAR), enrofloxacina (ENR, difloxacina (DIF), ácido oxolínico (OXO) y flumequina (FLU) cuyos límites máximos de residuos (LMRs) en tejidos animales comestibles están establecidos por la Regulación del Consejo Europeo 2377/90. Se optimizaron parámetros como la composición de tampón de separación y las condiciones del electrospray mediante la metodología del diseño de experimentos con objeto de obtener tanto una adecuada separación electroforética como una alta sensibilidad. Con objeto de lograr el mínimo número de puntos de identificación requeridos por la Decisión Europea 2002/657/EC para conseguir una identificación inequívoca de estos residuos se llevaron a cabo experimentos MS/MS, utilizando un analizador de trampa de iones en modo MRM (monitorización de respuesta múltiple). Para la cuantificación de los compuestos en muestras de leche cruda de vaca se desarrolló un procedimiento de SPE en dos pasos empleando cartuchos Oasis® MAX y HLB, sin necesidad de llevar a cabo una precipitación de proteína previa. Se obtuvieron resultados satisfactorios en términos de linealidad (R2 entre 0,989 y 0,992) y precisión (DER por debajo del 18%). Los límites de detección y cuantificación (por debajo de 6 y 24 ng/mL, respectivamente) fueron en todos los casos inferiores a los LMRs tolerados para estos compuestos en leche. Las recuperaciones estaban comprendidas entre el 81 y el 110 % lo que indica el potencial de la CZE-MS/MS para la determinación de quinolonas reguladas y su aplicación en control de calidad y seguridad alimentaria.
En el capítulo 5 se ha desarrollado y validado un método de CE-MS/MS empleando un dispositivo de extracción en fase sólida in-line, también denominado concentrador de analitos (AC), para determinar las ocho quinolonas de uso veterinario anteriormente mencionadas. Se estudiaron diferentes parámetros que afectan al rendimiento del AC tales como su diseño (en este caso empleamos un AC sin fritas), el tipo de sorbente (Oasis® MCX), pH de la muestra, volumen y composición del bolo de elución, y el tiempo de inyección. La validación del método empleando disoluciones patrón mostró unos límites de detección entre 17 y 59 ng/L. Finalmente, se desarrolló un método para determinar estos antibióticos en muestras de músculo de pollo empleando la extracción líquida presurizada (PLE). El método analítico completo fue validado en términos de linealidad (R2 ¿ 0.992), estudios de recuperación (63-112%), repetibilidad y precisión intermedia (DER ¿ 20%), límites de detección (40-140 ng/kg) y cuantificación (130- 470 ng/kg). Los resultados obtenidos demuestran la utilidad de la combinación de la SPE in-line con la CE, la detección con espectrometría de masas en tándem y la extracción líquida presurizada para la identificación y cuantificación simultánea de las ocho quinolonas reguladas en músculo de pollo a bajos niveles de concentración.
Finalmente en la tercera parte de la memoria se propone una nueva metodología para la determinación de triazinas. Así, el capítulo 6 describe el trabajo realizado en colaboración con el grupo del Prof. Pat Sandra durante la estancia predoctoral en el Laboratorio de Ciencias Separativas del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Gante (Gante, Bélgica), relacionado con los objetivos del proyecto "Nuevas estrategias basadas en técnicas miniaturizadas acopladas con detección por fluorescencia y espectrometría de masas para el control de pesticidas y fármacos en muestras ambientales y biológicas" (Ref.: CTM2006-06363, Ministerio de Educación y Ciencia).
En este trabajo se ha continuado con la aplicación de los preconcentradores in-line pero en este caso se ha evaluado el empleo de un polímero impreso molecularmente (MIP) como sorbente para la extracción en fase sólida in-line con la CE. Concretamente este desarrollo se ha aplicado a la determinación simultánea de herbicidas triazínicos: atrazina (ATZ) y sus tres productos de degradación: desetilatrazina (DEA), desisopropilatrazina (DIA) y desetildesisopropilatrazina (DEIA) en muestras de orina. Inicialmente se optimizó la separación electroforética de estos compuestos. El electrolito consistió en una disolución acuosa de 75 mM de ácido fosfórico ajustado a pH 2,1 que contenía 0,7 mM de bromuro de cetiltrimetilamonio. Después de la fabricación y el montaje del concentrador en el capilar se aplicaron las condiciones óptimas de separación para evaluar el rendimiento de esto dispositivo. Se consiguieron eficacias de 40.000 hasta 55.000 platos con un tiempo de separación de 1 h. Se optimizaron diversos parámetros que afectan a la extracción usando MIPs in-line con la CE, tales como la composición y el volumen del bolo de elución. El método se evaluó en términos de linealidad, precisión y límites de detección y cuantificación. El concentrador in-line construido utilizando MIPs como sorbente se comparó con otro similar al descrito en el capítulo anterior, empleando como sorbente partículas de un cartucho de SPE Oasis® HLB. La mayor selectividad de los MIPs se demostró a través de una inyección directa de muestras de orina dopadas con 10 µg/mL de ATZ, DEA, DIA y DEIA. Las recuperaciones estuvieron comprendidas entre el 92 y el 102 % comparando las señales con las obtenidas para una muestra en disolución acuosa, demostrándose así la validez de la metodología propuesta.
