Nuevos copolímeros con carácter catiónico con aplicaciones en terapia genética

• Autores: Juan Alfonso Redondo Marín
• Directores de la Tesis: Alberto Gallardo Ruiz (dir. tes.), Carlos Elvira Pujalte (codir. tes.), Helmut Reinecke (codir. tes.), Carmen Maestro Rubio (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Tomás Torres Cebada (presid.), Ángel Emilio Lozano López (secret.), José Luis López Comba (voc.), María Fernández García (voc.), Belén Levenfeld Laredo (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Genética
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • NUEVOS COPOLÍMEROS CON CARÁCTER CATIÓNICO CON APLICACIONES EN TERAPIA GÉNICA La terapia génica se define como la transferencia de material genético, ya sea ADN o ARN, con el objetivo de tratar o prevenir una enfermedad. Para llevar a cabo este proceso se necesita una copia funcional del gen que codifica la proteína cuya expresión nos permitirá recuperar la función normal del órgano o tejido tratado. La regulación de la expresión de este gen se consigue mediante su integración dentro de un plásmido bajo el control de un promotor. Finalmente, en muchos casos es también necesario un vector o sistema de vehiculización de ADN, que permite proteger el material genético y neutralizar la carga negativa del ADN.

    La investigación realizada en la presente tesis doctoral se basa en la hipótesis de que la distribución de las unidades monoméricas, es decir, la distribución de cargas a lo largo de estas cadenas, posee una gran influencia en la eficiencia de estos sistemas al ser utilizados como vectores no virales. En concreto, se han sintetizado y caracterizado diferentes monómeros catiónicos, portadores de grupos amino terciarios capaces de participar en el mecanismo conocido como la ¿esponja de protones¿, y monómeros de naturaleza neutra, que fueron posteriormente copolimerizados mediante copolimerización radical convencional. En concreto se han sintetizado dos series de copolímeros derivados de la metacrilamida de hidroxipropilo (HPMA), un monómero neutro e hidrosoluble ampliamente utilizado en aplicaciones biomédicas debido a su gran biocompatibilidad, que ha sido copolimerizado en primer lugar con la metacrilamida de N-(2-aminoetil) pirrolidina (EPA), y en segundo lugar, con dos monómeros metacrílicos derivados de la amina prodendrónica N,N,N¿,N¿-tetraetildietilentriamina (TEDETA), obtenidos mediante una novedosa ruta de síntesis basada en una adición de Michael selectiva sobre entrecruzantes diacrílicos asimétricos. Finalmente se obtuvieron nuevas series de copolímeros mediante la copolimerización de la unidad catiónica EPA con unos derivados metacrílicos de las formas hidroxilada y permetilada de ¿-glucosa y ß-ciclodextrina (ß-CD).

    Estos polímeros fueron evaluados como posibles vectores no virales en terapia génica, mediante la determinación de su capacidad de complejar ADN formando complejos polielectrolíticos. Estos complejos fueron posteriormente evaluados respecto a su eficiencia de transfección y biocompatibilidad in vitro, utilizando fibroblastos Swiss-3T3 de ratón, y en algunos casos celulas epiteliales de origen tumoral B16, como líneas celulares de estudio.

    En todas las series poliméricas estudiadas, la presencia del monómero neutro en los copolímeros incrementa tanto su citocompatibilidad, como su eficiencia de transfección. Este resultado demuestra que la combinación estadística de estas dos unidades a lo largo de la cadena (una disposición estructural poco reflejada en la literatura) puede tener un efecto beneficioso en sus propiedades finales, posiblemente debido a la modulación de las propiedades del complejo y de la respuesta celular al mismo (internalización, liberación citoplasmática, etc.) ejercida por la presencia de la unidad neutra en la cadena polimérica. En todos los casos existe una determinada proporción en la que se obtienen resultados superiores a los de cualquiera de los controles, observándose cómo es siempre necesaria una densidad de carga positivia mínima para posibilitar el proceso de complejación, mientras que un exceso de carga incrementa la toxicidad de los sistemas.

    En el caso específico de los copolímeros derivados de las unidades glucosídicas, la utilización de derivados permetilados tanto de ¿-glucosa como de ß-CD, da lugar a polyplexes con un tamaño de partícula inferior en promedio al obtenido con los polímeros derivados de la forma hidroxilada de estos azúcares, debido al carácter estabilizante de los derivados permetilados. Estos sistemas permetilados mostraron, además, en todos los casos niveles de viabilidad celular superiores a los obtenidos con sus homólogos polihidroxilados y con los polímeros control, destacando en este aspecto de citocompatibilidad el polímero MCDSt10. Este comportamiento diferencial se puede atribuir a la mayor anfifilia de los derivados permetilados, que permite una mayor interacción con la membrana celular. Estos estudios se han llevado a cabo de forma simultánea con dos líneas celulares, fibrobastos Swiss 3T3 y células tumorales B16. La eficiencia de transfección comparativa entre las dos líneas celulares ha sido muy similar para todos los polímeros glucosídicos, permetilados o no. La única diferencia observada fue que en todos los casos los niveles de transfección en las células tumorales fueron cercanos o, incluso superiores, al doble de los obtenidos en los fibroblastos. El comportamiento en viabilidad celular también es comparable entre las dos líneas excepto para los sistemas derivados de la forma permetilada de glucosa MGLCSt35 y MGLCSt70, que han mostrado una interesante toxicidad diferencial.

    PALABRAS CLAVE Terapia génica Transfección Vector no viral Esponja de protones Adición de Michael Metacrilamida Ciclodextrina Glucosa Citocompatibilidad