Resumen de Enlaces de hidrógeno cooperativos en medio acuoso: Glico-oligoamidas ligandos del surco menos del adn
RESUMEN TESIS DOCTORAL MARÍA TERESA BLÁZQUEZ SÁNCHEZ ENLACES DE HIDRÓGENO COOPERATIVOS EN MEDIO ACUOSO: GLICO-OLIGOAMIDAS LIGANDOS DEL SURCO MENOR DEL ADN ¿ INTRODUCCIÓN La línea general de investigación de la tesis tiene como objetivo el estudio del conocimiento de los factores estructurales y energéticos implicados en el reconocimiento molecular entre carbohidratos y el ADN.
La relevancia de la asociación entre el carbohidrato y el ADN se puso de manifiesto con el estudio del modo de acción de la familia de las calicheamicinas [1]. En este caso el carbohidrato presente en la estructura se une al surco menor del ADN y confiere al fármaco selectividad de secuencia [2].
La estrategia que se está desarrollando en nuestro grupo de investigación permite acercar carbohidratos de estructura sencilla y convenientemente diseñados al surco menor del ADN, de manera que se puedan estudiar las fuerzas intermoleculares que están involucradas en el proceso de asociación carbohidrato-ADN. Se ha seleccionado como molécula vector el fragmento de oligoamida que contiene dos unidades de N-metil-pirrol carboxamida (Py) unidas mediante un residuo de ácido-¿-amino butírico (-Py-¿-Py-) incorporándose un residuo de indol en el extremo N-terminal. Esta molécula vector, (-Py-¿-Py-Ind), será el vehículo transportador de carbohidratos hacia el surco menor del ADN.
¿ MEMORIA En nuestro grupo de trabajo se han realizado estudios de interacción de glico-oligoamidas, (compuestos que contienen un carbohidrato en el extremo C-terminal de la oligoamida), con macromoléculas de ADN [3] que han mostrado que son ligandos del surco menor del ADN eficaces y que interaccionan con secuencias ricas en pares de bases AT. Además se han realizado estudios estructurales en disolución, tanto de los ligandos libres como de sus complejos con ADN polimérico. La conclusión más importante de la comparación de los experimentos de RMN (TR-NOESY y STD), [4] de los complejos formados entre glico-oligoamidas y ADN, es que, las que contienen en su estructura carbohidratos de la serie D, en el complejo, los centros asimétricos del carbohidrato C5-C6-O5 quedan orientados hacia el interior del surco menor. Por el contrario, en la serie L, son los centros C2-C3-C4 del carbohidrato los que se orientan hacia el interior del surco menor. Este dato estructural es importante a la hora de diseñar glico-oligoamidas con carbohidratos que dirigen sus centros de enlaces de hidrógeno (EH) [5] hacia el interior o exterior del surco menor. Estudios preliminares realizados en el grupo han puesto de manifiesto la relevancia de la cooperatividad de EH en los procesos de reconocimiento. En dichos estudios se ha determinado que los EHs intramoleculares de un carbohidrato favorecen cooperativamente la formación de EHs intermoleculares tanto en la autoasociación de los carbohidratos estudiados como en procesos de reconocimiento molecular en medios apolares. Así, se ha comprobado la estabilización de los complejos entre carbohidratos y el par de bases CG [6] y demostrado la formación de una red de EH cooperativa entre determinados carbohidratos y grupos fosfato. [7] Estudios previos también confirmaron la formación de EH intramoleculares en derivados de Talosa y Manosa [8] con centros de EH cooperativos en distintas posiciones del carbohidrato en derivados solubles en medios apolares.
Concretamente, un objetivo particular de este proyecto es explorar la eficacia de los centros de EH [9] cooperativos en la interacción carbohidrato-ADN en medio fisiológico. Para ello, se ha llevado a cabo la síntesis de glico-oligoamidas de manosa y talosa, (¿-D-Man-Py-¿-Py-Ind y ¿-D-Tal-Py-¿-Py-Ind), y de los modelos no cooperativos de los derivados de glucosa y galactosa (¿-D-Glc-Py-¿-Py-Ind y ¿-D-Gal-Py-¿-Py-Ind). De acuerdo a los antecedentes mencionados anteriormente, otro objetivo particular de esta tesis es el estudio de los complejos formados entre glico-oligoamidas, con carbohidratos tanto de la serie D como de la serie L, con el ADN. Así se ha realizado la síntesis de las glico-oligoamidas ¿-L-Man-Py-¿-Py-Ind y ¿-L-Gal-Py-¿-Py-Ind y llevado a cabo estudios estructurales y de interacción con polímeros de ADN.
¿ RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL 1. Sintéticos: 1.1 Se han diseñado y sintetizado glico-oligoamidas con carbohidratos con centros dadores de EH cooperativos, (¿-D-Man-Py-¿-Py-Ind y ¿-D-Tal-Py-¿-Py-Ind), y no cooperativos ¿-D-Glc-Py-¿-Py-Ind y ¿-D-Gal-Py-¿-Py-Ind), asi como los modelos de hebra carbohidrato de ¿-D-Man-Py-NHAc y ¿-D-Tal-Py-NHAc por motivos comparativos.
1.2 Se han sintetizado glico-oligoamidas que contienen carbohidratos de la serie D y L derivadas de manosa y galactosa (¿-Man-Py-¿-Py-Ind y ¿-Gal-Py-¿-Py-Ind).
2. Estructurales: 2.1. Estudio conformacional: Se ha llevado a cabo el estudio de la conformación de todas las glico-oligoamidas sintetizadas en disolución acuosa por RMN y cálculos computacionales. Todas las glico-oligoamidas muestran una conformación plegada en disolución acuosa. Glico-oligoamidas con carbohidratos con OH-2 en posición axial muestran la cara ¿ próxima al indol, sin embargo, glico-oligoamidas con el OH-2 en posición ecuatorial orientan la cara ¿ del carbohidrato cercana al indol.
2.2. Caracterización de enlaces de hidrógeno intramoleculares en H2O: Se ha demostrado la existencia de uno y dos EH intramoleculares en los derivados de ¿-D-Man-Py-¿-Py-Ind y ¿-D-Tal-Py-¿-Py-Ind respectivamente en H2O mediante RMN y cálculos computacionales. OH-2 en ¿-D-Man-Py-¿-Py-Ind y OH-4 en ¿-D-Tal-Py-¿-Py-Ind podrían actuar como centros dadores de EH cooperativos en un proceso intermolecular con el ADN.
3. Interacción: 3.1 Estudios estructurales de los complejos con polímeros de ADN (ct-DNA y poly(dA-dT)2. Se ha determinado la existencia de interacción ligando-ADN y la estructura 3D de los complejos de las glico-oligoamidas sintetizadas con polímeros de ADN mediante experimentos TR-NOESY (obteniendo información a cerca de la conformación del ligando en el estado enlazado) y STD (identificación del epítopo del ligando).
3.2 Cuantificación de la interacción con poly(dA-dT)2. Se han obtenido las constantes de asociación de las glico-oligoamidas sintetizadas mediante RMN.
Los valores de las constantes revelan que Ka¿-D-Glc ¿ Ka¿-D-Man, Ka¿-D-Gal ¿ Ka¿-D-Tal, Ka¿-L-Man ¿ Ka¿-D-Man.
¿ CONCLUSIONES 1. Síntesis.
Se han desarrollado dos estrategias de síntesis (Ruta A y Ruta B) que han permitido obtener a escala de 30 mg glico-oligoamidas con carbohidratos de la serie D que contienen posibles centros dadores de EH cooperativos: ß-D-Man (1) y ß-D-Tal (2). También se han obtenido las correspondientes glico-oligoamidas con L-carbohdiratos, ß-L-Man (7), ß-L-Gal (8).
¿ Se ha obtenido la amina de talosa (AcO)4-ß-D-Tal-NH2 (28) a una escala de ~0.3 gramos.
¿ El empleo de la Ruta B ha dado lugar a la obtención del modelo de hebra azúcar ß-D-Tal-PyB-NHAc (6) a escala de ~0.3 g.
2. Estudios conformacionales de las glico-oligoamidas en el estado libre en disolución acuosa.
¿ Todas las glico-oligoamidas estudiadas 1-4 y 7-9 presentan un equilibrio conformacional en disolución acuosa donde existe un porcentaje apreciable de conformación en horquilla. Para esta geometría concreta, se puede definir una conformación arqueada con un arco interior delimitado por los grupos NH y un arco exterior delimitado por los grupos CH3 presentes en la estructura.
¿ Se ha comprobado que las glico-oligoamidas cuyo hidroxilo en C-2 está en configuración axial (ß-D-Man (1) y ß-D-Tal (2)) tienen una estructura en horquilla mejor definida, en disolución acuosa a ¿ 15 ºC y 5 ºC, que las glico-oligoamidas ß-D-Glc (3) y ß-D-Gal (4). Ambas mostraron parámetros de RMN (nOes y ¿¿/¿T) que indican proximidad de la cara ¿ del carbohidrato al indol y el establecimiento de interacciones CH-¿ que estabilizan la conformación. En el caso de ß-D-Glc (3), sin embargo, es la cara ß del carbohidrato la más próxima al indol. Los parámetros de RMN a baja temperatura permiten definir una conformación en horquilla con un plegamiento en sentido C¿N para ß-D-Man (1), ß-D-Tal (2) y ß-L-Man (7) y 6-desoxy-ß-D-Man (9) quedando los centros C2 y C3 del carbohidrato hacia el arco NH. Sin embargo la glico-oligoamida ß-D-Glc (3) con OH-2 ecuatorial adopta un sentido de plegamiento N¿C.
¿ El estudio conformacional a temperatura ambiente en 1-4 y 7-9 muestra que existe un equilibrio conformacional con un porcentaje de horquilla que está menos definida que a baja temperatura.
3. Caracterización de EHs intramoleculares en H2O.
¿ Se ha demostrando la existencia de centros dadores de EH cooperativos OH-2 y OH-4 en las glico-oligoamidas ß-D-Man (1) y ß-D-Tal (2) respectivamente por formación de las redes de EH intramoleculares NH-5¿¿¿OH-2 en ß-D-Man (1) y NH-5¿¿¿OH-2¿¿¿OH-4 en ß-D-Tal (2) en medio acuoso mediante RMN y cálculos de DM.
¿ La comparación de los datos espectroscópicos de ß-D-Man (1) y ß-D-Tal (2) con ß-D-Man-Py-NHAc (5) y ß-D-Tal-Py-NHAc (6) sugieren que las redes de EH intramoleculares en 5 y 6 no sobreviven en medio acuoso. Este resultado pone de manifiesto la posible influencia entre las interacciones CH-¿ (carbohidrato-indol) en 1 y 2 y el establecimiento de EHs intramoleculares estables en medio acuoso.
4. Estudios de interacción.
¿ Se ha determinado que todas las glico-oligoamidas estudiadas son ligandos neutros del surco menor del ADN que presentan una mayor afinidad hacia estructuras de ADN ricas en pares de bases AT.
¿ Se ha puesto a punto un experimento DF-STD de competición que ha permitido diferenciar entre ligandos del surco menor de poly(dA-dT)2 de otros que no lo son. Con dicho experimento se ha confirmado que el fragmento -Py-¿-Py-Ind es el fragmento mínimo necesario para que el carbohidrato interaccione con el ADN.
¿ Los experimentos TR-NOESY nos han permitido determinar la conformación plegada en disolución acuosa de todas las glico-oligoamidas tanto en sus complejos con ct-ADN como con poly(dA-dT)2. La glico-oligoamida ß-L-Man (7) es la que ha presentado una estructura en horquilla mejor definida en ambos complejos siendo la cara ¿ del carbohidrato la que se encuentra más próxima al indol.
¿ Los experimentos DF-STD han permitido determinar que el centro dador de EH cooperativo OH-2 en ß-L-Man (7) se orienta más cerca del interior del surco menor del ADN en ambos complejos. Sin embargo los centros O5, C5 y C6 de ß-D-Man (1) y ß-D- Tal (2) son los que se orientan más cerca del interior del surco menor del ADN en el complejo con poly(dA-dT)2.
¿ Los resultados de los experimentos TR-NOESY junto con los obtenidos de los DF-STD han mostrado que la glico-oligoamida ß-L-Man (7) posee una estructura plegada en horquilla con un sentido de plegamiento C¿N en su estado asociado tanto a ct-ADN como a poly(dA-dT)2.
¿ Se ha establecido un orden relativo de afinidades de las glico-oligoamidas por poly(dA-dT)2 mediante un protocolo que consta de dos tipos de experimentos diferentes: la determinación de las constantes de afinidad y la realización de experimentos de competición por valoración seguida por 1H-RMN. Estos estudios nos han permitido concluir que: En la serie de glico-oligoamidas de manosa, la glico-oligoamida con el carbohidrato de la serie L tiene una mayor afinidad por poly(dA-dT)2 que las correspondientes glico-oligoamidas derivadas de manosa de la serie D.
ß-L-Man (7) > ß-D-Man (1) > 6-desoxy-ß-D-Man (9) ¿ Los datos estructurales de los complejos con poly(dA-dT)2 y el orden relativo de afinidades permite concluir que: existe una correlación entre la afinidad de las glico-oligoamidas derivadas de manosa (1, 7 y 9) y la orientación del centro dador de EH cooperativo OH-2. Asi, la orientación de dicho centro, más cerca del interior del surco menor del ADN, en el caso de ß-L-Man (7), está de acuerdo con una mayor afinidad de dicha glico-oligoamida por el poly(dA-dT)2.
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