Análisis molecular de la proteína portadora del cofactor de molibdeno de Chlamydomonas Reinhardtii

• Autores: Ataya Ataya Farid Shokry
• Directores de la Tesis: Emilio Fernandez Reyes (dir. tes.), María Isabel Igeño González (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2001
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Castillo Rodríguez (presid.), Manuel Ruiz Rubio (secret.), J. Antonio Bárcena Ruiz (voc.), Antonio José Márquez Cabeza (voc.), José María Vega Piqueres (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Proteínas
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• Resumen

  • En Chlamydomonas reinhardtii se encontró y purificó una proteína portadora de cofactor de molibdeno (MocoCP). Esta proteína funciona como donadora de cofactor de molibdeno (Moco) a la aponitrato reductasa (Witte et al., 1998). Se ha microsecuenciado esta proteína y se han diseñado oligonucleótidos degenerados que se han usado como cebadores para amplificar mediante PCR el gen que codifica para la MocoCP. Se ha aislado un clon de 1 kb correspondiente a la MocoCP y se ha estudiado la secuencia de este cDNA. El análisis de esta secuencia, mediante el programa GCG, mostró una región traducida correspondiente a una proteína de 165 aminoácidos con una masa molecular de 16,5 kDa y punto isoeléctrico de 6,1. Asimismo, se ha aislado el gen que codifica para la MocoCP (CrMcp1) y corresponde a un DNA de 2,5 Kb cuya fase abierta de lectura contiene 4 exones y 3 intrones. El promotor de CrMcp1 contiene muchas cajas posibles de regulación por luz (10) semejantes a diversas secuencias encontradas en promotores de genes de plantas, dos cajas de choque térmico y dos de control por nitrato. La MocoCP se ha clonado en el vector de expresión pGEX-KG y se ha expresado como proteína de fusión (glutatión transferasa-MocoCP) en E.coli. Esta proteína se ha purificado mediante cromatografía de afinidad (glutatión agarosa) hasta homogeneidad electroforética, de la que se liberó la MocoCP por digestión con trombina y se separó por cromatografía en la misma columna. La funcionalidad de esta proteína recombinante se ha demostrado mediante su capacidad de unión al Moco libre (procedente la xantina oxidasa). Un estudio a nivel bioquímico sobre la MocoCP recombinante indicó que ésta se ensambla en forma de heterómero y no une Moco bacteriano aunque puede unirse con alta afinidad al Moco extraído de XO de leche y complementar la actividad de la apoNR del mutante nit-1 del hongo N.crassa. La MocoCP recombinante protege al Moco unido frente a