Resumen de Desarrollo de un metodo para la deteccion simultánea de las mutaciones mas frecuentes de la beta-talasemia en españa
El aumento de hemoglobinopatías acontecido en los últimos años en nuestro país por los movimientos migratorios ha determinado la necesidad de ampliar los conocimientos clínicos, epidemiológicos y de diagnóstico que nos permitan afrontar mejor este problema de salud emergente.
La microcitosis es el dato de labora torio clásico para la detección de talasemias y es el que se ha empleado durante años para la detección de portadores, mostrando una buena sensibilidad. Su confirmación mediante el incremento de la Hb A2 permite realizar el diagnóstico de beta-talasemia. Sin embargo, estos estudios nunca pueden ser realizados en e 1 recién nacido dado que presenta cifras bajas o indetectables de Hb A2, e incluso en los pacientes homocigotos para la beta-talasemia, el diagnóstico no puede establecerse con seguridad hasta 3-6 meses tras el nacimiento. La única manera de poderlos diagnosticar con seguridad es mediante el análisis directo del gen con técnicas de biología molecular.
Este trabajo describe un método que permite la detección simultánea de una manera simple, rápida y con una alta discriminación de las mutaciones responsables de la b-talasemia usando la electroforesis capilar junto con la detección fluorescente.
El método se basa en la reacción de extensión de una única base para la determinación simultánea (multiplex) de las mutaciones más comunes asociadas con la b-talasemia: IV SI-l, IVSI-6, IVSI-ll0, CDS/9, CD6, CD37, CD39, IVSII-l y la Hb S.
El objetivo del presente trabajo se centra en la puesta a punto de un método de diagnóstico de las mutaciones responsables de la b-talasemia que permitan realizar un análisis genético tanto de pacientes b-talasémicos como en personas de riesgo, o en la población general con el objeto de poder usarse como una medida preventiva de esta enfermedad.
Por ello, nos planteamos el siguiente objetivo:
Desarrollo y puesta a punto de un método nuevo basado en la reacción de extensión de una única base para la determinación simultánea (múltiplex) de una manera si ple, rápida y con una alta discriminación de las mutaciones más comunes en España asociadas a la beta-talasemia (IVSI-1, IVSI-6, IVSI-110, CD8/9 , CD6, CD37, CD39, IVSII-1) y la Hb S usando la electroforesis capilar junto con la detección fluorescente, para el diagnóstico molecular tanto de pacientes beta-talasémicos como de personas de riesgo o en la población general con objeto de poder usarse como una medida preventiva de esta enfermedad.
Para lo cual hemos seguido el siguiente esquema metodológico: a) Diseño de oligonucleótidos específicos y análisis de las mutaciones relacionadas con la b-talasemia, mediante la incorporación específica por PCR en el punto exacto de la mutación de ddNTPs.
b) Análisis de los productos amplificados mediante electroforesis capilar y detección fluorescente.
Para llevar a cabo este trabajo se han analizado 125 muestras de sangre de pacientes derivados al Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Universitario "San Cecilio" con sospecha de -talasemia, basada en la presencia de al menos uno de los siguientes criterios: VCM < 81 fl Y HbA2 > 3.8 %La ele va da especificidad de la incorporación de un solo ddNTP, catalizado por una DNA polimerasa, junto con la electroforesis capilar y detección fluorescente hace que la reacción SNaPshot sea un método adecuado para la determinación de los polimorfismos de un solo nucleótido responsables de la -talasemia.
Las condiciones ideales para la detección de las mutaciones responsables de la -talasemia desarrollada en este trabajo han sido las siguientes:
a) reacción de amplificación del amplicón: concentración de DNA 50 ng, , una concentración de cebadores de 0,2 M, 200 ?M dNTPs, 1,5 mM de C12Mg, 1 U Taq Gold DNA Polymerase (App lied Biosystems), IX buffer PCR 11 (contiene 10 mM Tris-HCl pH 8.3 Y 50 mM KC1), en un volumen final de reacción de 25?1. El Programa de amplificación fue el siguiente: desnaturalización inicial de 10 min a 95 º C, 30 ciclos a 95º durante 30 s, con una temperatura de 55º durante 30 s y a 72 º C durante 2 mini y una extensión final a 72 º C durante 7 min.
b) reacción de extensión de un único nucleótido: La reacción de SNaPshot contenía, en un volumen f inal de 10 L: 5 L de "SNaPshot multiplex Ready Reaction Mix", 3 L del producto de amplificación y una concentración final d e 0,2 M de cebadores. El programa de amplificación fue el siguiente: 10 min a 96 º C, seguido de 30 ciclos a 95°C durante 15 s , 59 º C durante 1 min.
La aplicación de este método ha permitido identificar el 73 % de los alelos responsables de la -talasemia que se agrupan en cinco mutaciones diferentes (IV8I-1, IV 81-6, IV8I-110, CD8/9 y CD39).
La frecuencia alélica de las mutaciones detectadas ha sido la siguiente: 44.8% para la mutación CD39 seguida en frecuencia por la mutación IV8I-110 con 19, 2%, IV8I-1 con 16.6%, la CD8/9 con un 12.8% Y la IV8I-6 con un 5.1%.
De los 125 casos estudiados se ha detectado un individuo con Hb S en heterocigosis.
