Resumen de Caracterizacion funcional y estructural de lmm-pbp4 y analsis de su papel modulador en la integridad molecular del peptidoglicano para el modelo pseudomonas aeruginosa
Las infecciones nosocomiales y comunitarias por Pseudomonas aeruginosa continúan representando un desafío terapéutico importante, donde la elección del antibiótico apropiado es fundamental. La resistencia de este patógeno frente a antibióticos ß-lactámicos, se encuentra principalmente determinada por la producción de enzimas inactivantes (ß-lactamasas) de tipo AmpC, cuyo mecanismo regulador es mucho más complejo que el presente en miembros de la familia Enterobacteriaceae, al incluir una proteína AmpR comprometida en la regulación de genes adicionales a ampC, como ampE y creD (sistema regulador de dos componentes CreBCD), además del gen dacB (LMM-PBP4), involucrado en la hiperproducción constitutiva de esta cefalosporinasa. La correspondencia entre los procesos de recambio y reciclaje de peptidoglicano, y las vías regulatorias para la hiperproducción constitutiva de ß-lactamasa cromosomal AmpC, particularmente el mecanismo relacionado con la inactivación de PBP4, plantea la necesidad de realizar una detallada investigación estructural y funcional para esta LMM-PBP clase C subclase C1 de Pseudomonas aeruginosa, que permita establecer similitudes y diferencias con otras Penicillin-Binding Proteins de baja masa molecular en este modelo bacteriano, y entre ortólogos funcionales de especies relacionadas, evaluando además, su participación en el metabolismo de la pared celular y en la biología de la resistencia frente a antibióticos ß-lactámicos.
El planteamiento metodológico diseñado y ejecutado para el abordaje de esta Thesis, demostró la carencia de actividad ß-lactamasa para la forma nativa de LMM-PBP4, la presencia de actividades de tipo D,D-carboxipeptidasa y D,D-endopeptidasa en esta proteína (definiendo como predominante esta última actividad) y su ausencia en el sitio de división celular, descartando su asociación con proteínas septales y del divisoma bacteriano. Su localización subcelular en membrana interna y espacio periplásmico, fortalece su propuesta como potencial hidrolasa-autolisina asociada a procesos de maduración-reciclaje de peptidoglicano. La alta afinidad demostrada entre antibióticos ß-lactámicos cefoxitina e imipenem y LMM-PBP4 (purificada y unida a membrana), se correlaciona con la actividad de binding para este tipo de proteínas y su probable inactivación e hiperproducción constitutiva de ß-lactamasa AmpC. El modelo estructural para la unidad monomérica de LMM-PBP4 comprueba la presencia de dominios II y III, que la definen como LMW-PBP clase C subclase C1, hace posible estimar las dimensiones para la cavidad del sitio activo que favorecen el acceso a sustratos de mayor longitud y reconoce la existencia de un aminoácido treonina en posición 386 (T386) que permitiría acomodar la cadena peptídica de una segunda hebra de peptidoglicano. Estos antecedentes constitutivos apoyan el desarrollo de una actividad D,D-endopeptidasa en esta proteína.
El análisis de la pared celular, en relación a su composición en muropéptidos para cepa de referencia y mutantes en proteínas reguladoras de la producción de AmpC (DacB, AmpE, AmpDh2), en condiciones naturales y de complementación-sobreexpresión e inactivación antibiótica de LMM-PBP4, no exhibe cambios que permitan proponer un sistema de activación de ampC a través de un efector de naturaleza pentapeptídica, pero confirma in vivo la bifuncionalidad D,D-peptidasa antes mencionada. Se logró además la identificación de nuevos muropéptidos asociados a estructura y funcionalidades no descritas en Pseudomonas aeruginosa.
