Identificación y caracterización de un motivo de RNA similar al elemento GAIT en el extremo 3' del genoma del TGEV que modula la respuesta inmune innata

• Autores: Silvia Marquez Jurado
• Directores de la Tesis: Luis Enjuanes (dir. tes.), Fernando Almazán Toral (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Antonio Melero Fondevilla (presid.), Iván Ventoso Bande (secret.), Javier Mª Rodriguez Martinez (voc.), Margarita del Val Latorre (voc.), María Dolores Rodríguez Aguirre (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Virología
      • Virus respiratorios
  • Ciencias médicas
    • Patología
      • Inmunopatología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Los Coronavirus (CoV) son virus con envuelta y un genoma de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva. Los CoVs pertenecen al orden Nidovirales y causan infecciones respiratorias y entéricas en animales y humanos. Los procesos de replicación y transcripción de CoV son llevados a cabo por la replicasa viral en vesículas de doble membrana y requieren el reconocimiento especifico de elementos de RNA en cis localizados en ambos extremos del genoma viral. De manera similar a lo que se ha descrito para otros virus RNA, el complejo de replicación codificado por el virus se asocia, presumiblemente, con proteínas celulares para completar la síntesis del RNA viral. Usando como modelo el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV) se habían identificado previamente en el laboratorio nueve proteínas celulares que interaccionaban específicamente con el extremo 3¿ del genoma viral, entre las que se incluían las proteínas heterogéneas nucleares (hnRNPs) A0, A1, A2/B1, Q y U, los factores de traducción glutamil-prolil-tRNA sintetasa (EPRS), arginil-tRNA sintetasa (RRS) y la proteína de unión a poliA (PABP), y el factor transcripcional p100. El análisis funcional de estas proteínas mediante silenciamiento génico demostró que las proteínas hnRNP Q, ERPS y PABP presentaban un papel positivo en la síntesis de RNA viral. En esta tesis, este estudio funcional se ha extendido a las proteínas RRS y p100, demostrándose que ambas proteínas juegan también un papel positivo en la síntesis del RNA viral.

    Para estudiar el mecanismo de acción de las proteínas celulares implicadas en la síntesis de RNA del TGEV se analizaron los motivos de RNA viral con los que interaccionaban mediante cromatografía de afinidad a RNA. Tras varias fases de mapeo, se identificó un motivo de 32 nt en el extremo 3¿ del genoma que interaccionaba específicamente con las proteínas EPRS y RRS. Esta interacción se observó también durante la infección, donde ambas aminoacil-tRNA sintetasas interaccionaron tanto con el RNA genómico como con los mRNAs virales. Por otra parte, se ha demostrado que ambas proteínas se incorporaron en la partícula viral, posiblemente a través de su interacción con el RNA genómico viral. El análisis de la secuencia del motivo de RNA de 32 nt mostró una alta similaridad de secuencia y estructura secundaria con el elemento silenciador de la traducción inducido por interferón gamma (elemento GAIT) que está presente en el extremo 3¿UTR de diversos mRNAs celulares que codifican proteínas proinflamatorias. El elemento GAIT, a través de su interacción con el complejo proteico GAIT (EPRS, hnRNP Q, L13a y GAPDH), induce el silenciamiento la traducción de los mRNAs que lo contienen con el fin de favorecer la resolución de la inflamación. De manera similar al elemento GAIT celular, el dominio de RNA viral era capaz de unir el complejo GAIT e inhibir la traducción in vitro de un mRNA quimérico que lo contenía, sugiriendo que el dominio de RNA viral podría constituir el primer motivo de RNA similar al elemento GAIT descrito en un virus RNA de polaridad positivo.

    Para estudiar el papel funcional del motivo de RNA similar al elemento GAIT en la infección viral se construyeron y caracterizaron dos virus recombinantes con mutaciones en este dominio. La destrucción del motivo de RNA similar al elemento GAIT no afectó al crecimiento viral en cultivos celulares. Sin embargo, en células infectadas con los virus mutantes se observó una la respuesta inmune innata exacerbada mediada por MDA5 en comparación con células infectadas con el virus parental. En conjunto, estos datos indican que le motivo de RNA similar al elemento GAIT modula la respuesta inmune innata del hospedador.