Resumen de Estudio metalómico/metabolómico comparativo del ratón de laboratorio Mus musculus y del ratón de vida libre Mus spretus para evaluar el estrés ambiental de ecosistemas terrestres
- español
La diagnosis del estrés ambiental, precisa la combinación de ensayos químicos de los contaminantes en el medio, con el conocimiento de la respuesta biológica a dichos contaminantes. Esta respuesta puede evaluarse mediante experiencias de exposición, que integren los procesos de sinergismo/antagonismo entre contaminantes y la interacción con sustancias de los ecosistemas. Durante todo el período de la presente Tesis Doctoral, se ha utilizado el ratón de vida libre Mus spretus como bioindicador de la contaminación terrestre ocasionada por metales tóxicos en un entorno ecológico de referencia como es el Parque Nacional de Doñana. Estos estudios se han centrado en el uso de las tecnologías ómicas en este bioindicador en la zona de referencia amenazada por la contaminación de metales tóxicos. Los estudios realizados han permitido profundizar en el conocimiento relacionado con el tráfico de metales, interacciones entre ellos y homeostasis en estos organismos de vida libre. El Parque Nacional de Doñana, a pesar de haber sido declarado como Reserva de la Biosfera, especialmente para aves migratorias, se ve amenazado por diversas actividades naturales y antropogénicas que se desarrollan en su entorno, como actividades agrícolas, mineras e industriales.
Para este propósito, se han desarrollado y aplicado metodologías metalómicas que han permitido el estudio de la contaminación metálica presente en la zona de estudio centradas en el uso de un detector de plasma acoplado inductivamente-espectrometría de masas (ICP-MS). Además, se han aplicado metodologías metabolómicas basadas en la infusión directa a un espectrómetro de masas de alta resolución (DI-ESI-QTOF- MS) y la cromatografía de gases con detector de masas (GC-MS), seguido del análisis discriminante de los resultados (PLS-DA), para comparar la respuesta biológica de Mus spretus procedentes de diferentes áreas del Parque Nacional de Doñana y sus alrededores.
Por otro lado, se han desarrollado estudios paralelos de la Tesis para la evaluación de los efectos toxicológicos de metales como As, Cd, Hg en el ratón de laboratorio Mus musculus sometido a experimentos de exposición controlados. Además, se ha desarrollado un enfoque metalómico basado en el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) acoplada a ICP-MS, con objeto de conocer mejor los cambios funcionales de las metalobiomoléculas, los procesos de desintoxicación y la regulación de los metales en los ratones (Mus musculus) bajo estas experiencias de exposición que pueden ser comparadas con procesos análogos que se produzcan en el medio ambiente.
Estos estudios han sido complementados con técnicas innovadoras basadas en el uso de la dilución isotópica (IDA) para cuantificar el selenio y el cobre asociado a las proteínas citosólicas y las presentes en el torrente sanguíneo, utilizando un sistema ICP-MS como detector multielemental. Esta metodología ha sido desarrollada y validada por cromatografía multidimensional basada en 2D/SEC-AF-HPLC-SUID-ICP-ORS-MS, 3D/SEC-AF- AEC-HPLC-SUID-ICP-ORS-MS para la cuantificación absoluta de especies de selenio y 2D/SEC-AEC-HPLC- SUID-ICP-ORS-MS para la especiación de metalo proteínas que contienen Cu. Además, se ha utilizado un procedimiento de deconvolución isotópica (IPD) para estudiar el transporte y destino final del 77Se (selenito) en ratones Mus musculus sometidos a la exposición a cadmio y el efecto de este elemento tóxico en las selenoproteínas del plasma.
Los estudios medioambientales dirigidos a identificar respuestas biológicas de contaminantes ambientales encuentran serias dificultades en su aplicación, ya que deben enfrentarse a la complejidad de los ecosistemas, en los que coexisten numerosos xenobióticos que afectan a los organismos, pero que además interaccionan entre sí y se comportan de forma diferente ante los diversos filtros biológicos, y como consecuencia de ello, resulta difícil establecer claramente las relaciones causa-efecto por la multiplicidad de posibles respuestas. Por ello, para establecer de forma segura los mecanismos de acción de los contaminantes hay que recurrir a estudios de exposición en el laboratorio que permitan un control adecuado de todas las variables relacionadas con dichos compuestos. Por último las conclusiones que resulten pueden extrapolarse y validarse en animales de vida libre en campañas adecuadas de muestreo en el campo. Todos estos aspectos considerados en relación al estudio de la contaminación y sus efectos, constituyen la finalidad de esta Tesis Doctoral, sobre la que se apoyan los objetivos que se proponen más adelante.
- English
Diagnosis of environmental stress requires the combination of chemical analysis of contaminants with biological responses. This response can be estimated by biological exposure experiments, which integrate synergism/antagonism process among contaminants and interactions with other compounds in the ecosystems. Throughout the period of this PhD thesis, we used the free-living mouse Mus spretus as bioindicator of terrestrial pollution caused by toxic metals in an ecological environment like Doñana National Park. These studies have focused on the use of omics technologies in this bioindicator in the reference area threatened by pollution from toxic metals. Studies have deepened in the knowledge related to the trafficking of metals, including interactions and homeostasis in these free-living organisms. Doñana National Park, despite it has been declared a Biosphere Reserve, especially for the presence of migratory birds, is threatened by various natural and anthropogenic activities taking place in the surroundings, such as industrial, mining and agricultural activities.
For this purpose, we have developed and applied metallomic methodologies in order to study metal contamination in this area, which have been centered in the use of a detector inductively-coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Furthermore, the application of metabolomic methodologies based on direct infusion into a high resolution mass spectrometer (DI-ESI-QTOF-MS) and gas chromatography with mass detector (GC- MS), followed by discriminant analysis of the results (PLS-DA) has been used to compare the biological response of Mus spretus from different areas of the Doñana National Park and surrounding areas.
On the other hand, parallel studies have been developed throughout this thesis based on the evaluation of the toxicological effects of metals, such as As, Cd, Hg on the laboratory mouse Mus musculus under controlled exposure experiments. Furthermore, we have developed a metallomic approach based on the use of size exclusion chromatography (SEC) coupled to ICP-MS, in order to get a better understanding of functional changes suffered by metallo-biomolecules, the detoxification processes and regulation of metals in mice (Mus musculus) under these exposure experiences that can be compared to similar situations occurring in the environment. In this sense, we have conducted experiments exposure to undertake the study of the potential biological interactions Mus musculus, firstly to evaluate the protective effect of selenium against the toxicity of mercury and cadmium, and on the other side to deep insight into the antagonistic or synergistic effects when arsenic and cadmium are administered simultaneously.
Furthermore, these studies have been complemented with innovative techniques based on the use of isotope dilution (IDA) to quantify selenium and copper associated with the cytosolic proteins and other molecules in the blood stream, using an ICP-MS system and multielement detector. This methodology has been developed and validated by multidimensional chromatography methods based on 2D/SEC-AF-HPLC-SUID-ORS-ICP-MS, 3D/SEC-AF-AEC-HPLC-SUID-ORS-ICP-MS for absolute quantification selenium species and 2D/SEC-AEC- HPLC-SUID-ORS-ICP-MS for speciation of metalloproteins containing Cu. In addition, an isotopic pattern deconvolution methos has been used to study the transport and fate of 77Se (selenite) in mice under cadmium exposure and the effect of this toxic element in plasma selenoproteins.
In summary, environmental studies aimed at identifying biological responses to environmental pollutants present serious difficulties in their application, as they must deal with the complexity of ecosystems in which many xenobiotics affecting organisms coexist, but also interact with each other and they behave differently to the various biological filters. As a result, it is difficult to pinpoint the cause-effect by the multiplicity of possible answers. Despite these drawbacks, this type of study is very necessary as integrate all variables in a particular ecosystem and its interaction with the organisms studied. Therefore, to establish secure mechanisms of action of contaminants exposure studies in the laboratory are mandatory to allow adequate control of all the variables related to these compounds. Finally, the conclusions obtained can be extrapolated and validated in free-living animals in suitable sampling campaigns in the field. All these aspects considered in relation to the study of pollution and its effects, are the purpose of this thesis, to which the objectives proposed below are supported.
