Resumen de Obtención y carcterización de híbridos interespecíficos en pisum y lathyrus
RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D. Alfredo Bolaños Herrera Obtención y caracterización de híbridos interespecíficos en Pisum y Lathyrus 1. introducción o motivación de la tesis El presente trabajo se ha desarrollado con los géneros Pisum y Lathyrus de la familia de las leguminosas. En los cultivos en que la variabilidad genética dentro del pool genético primario es reducida, es necesario recurrir, a la hibridación interespecífica, para enriquecer la base genética sobre la cual se fundamenten los programas de mejora.
En el pool genético primario del guisante (Pisum sativum subsp. sativum)se han identificado genes de resistencia a la ascoquitosis (Mycosphaerella pinodes) (Fondevilla et al., 2007a; Fondevilla et al., 2005), al oídio (Erysiphe pisi) (Fondevilla et al., 2007b), a la roya (Uromyces pisi) (Barilli et al., 2009) y a jopo (Rubiales et al., 2005). En la especie silvestre, P. fulvum, se han identificado genes de resistencia a oídio (Fondevilla et al., 2007b), jopo (Pérez-De-Luque et al., 2005) y a ascoquitosis (Fondevilla et al., 2007a; Fondevilla et al., 2008), por lo que esta especie puede ser la de mayor interés para la mejora del guisante. La especie de más interés para la mejora de la almorta es L. cicera. La evaluación de germoplasma de L. cicera ha permitido identificar entradas que poseen genes de resistencia a oídio (Erysiphe pisi) (Vaz Patto et al., 2006; Vaz Patto et al., 2007), jopo (Orobanche crenata) (Fernández-Aparicio y Rubiales, 2010; Fernández-Aparicio et al., 2012) y roya (Uromyces pisi y U. viciae-fabae) (Vaz Patto et al., 2009).
La presente Tesis plantea como objetivo general obtener líneas de introgresión de Lathyrus cicera en L. sativus y de Pisum fulvum, P. abyssinicum y tres subespecies de de P. sativum en P. sativum subsp. sativum con el fin último de ampliar la base genética de la almorta y el guisante. Así como analizar el empleo de la citometría como una herramienta de ayuda a la selección de líneas de introgresión de L. cicera en L. sativus.
2. Contenido de la investigación Se ha analizado la composición genómica de una muestra de plantas de las generaciones F4 y F5 originadas del cruzamiento L. cicera x L. sativus, así como de las generaciones F1 y F2 originadas del cruzamiento del guisante (P. sativum subsp. sativum) con cuatro guisantes silvestres y con las especies P. abyssinicum y P. fulvum. Además se ha analizado la posibilidad de utilizar la citometría de flujo para separa plantas con la sustitución monosómica del cromosoma 5 de L. cicera de las plantas hermanas euploide. Los análisis genómicos se realizaron mediante la hibridación in situ con los marcadores citológicos pTa71 (Gerlach y Bedbrook, 1979) y S5 (Lee et al., 1999) (FISH) y con ADN genómico total de las dos líneas parentales (GISH), según el protocolo de Cabrera et al. (2002). Se ha utilizado el programa imagen (Ferreira y Rasband, 2012; Shamir et al., 2010) para analizar los resultados de la GISH de las plantas de las generaciones F2 procedentes del cruzamiento P. sativum x P. fulvum. La citometría de flujo se ha realizado según la metodología de Moreno et al. (2008). El análisis genómico con las secuencias pTa71 y 5S y con el ADN genómico total, de las plantas de la generación F4 provenientes del cruzamiento de L. cicera x L. sativus, mostró que todas ellas tienen 14 cromosomas y que el genoma predominante es el de L. sativus. En todas las plantas analizadas se observó cromatina de L. cicera, ya fuese como sustituciones cromosómicas o como cromosomas recombinantes. Se han detectado ocho plantas con el cromosoma 6 recombinante en homocigosis. Estas plantas fueron de porte bajo, entrenudos cortos, floración terminal y estériles. Los resultados del análisis de las plantas de la generación F4 procedentes del cruzamiento L. cicera x L. sativus con las secuencias pTa71 y 5S, junto con el análisis GISH, han permitido establecer el orden de los cromosomas en L. cicera. Los índices de fluorescencia relativa de las plantas portadoras de la sustitución monosómica del cromosoma 5 fueron menores que los valores obtenidos para las plantas euploides hermanas. Este resultado permitió identificar las planas con mayor probabilidad de portar el genotipo deseado reduciéndose el número de plantas a analizar por FISH. El análisis FISH de las plantas de P. fulvum ha permitido establecer la localización física de la subunidad 5S de rADN.
3.Conclusión Se han generado líneas de introgresión de L. cicera en L. sativus. Las líneas obtenidas incluyen tanto sustituciones cromosómicas como cromosomas recombinantes. El análisis de la composición genómica de las líneas de introgresión ha permitido modificar el orden de los cromosomas en el cariotipo de L. cicera, estableciéndose una nueva relación de homología entre L. cicera y L. sativus.
La presencia en homocigosis del cromosoma 6 recombinante entre L. cicera y L. sativus en el fondo genético de L. sativus podría estar asociada al crecimiento determinado de las plantas con este genotipo.
La citometría de flujo puede utilizarse como un método de preselección de los genotipos deseados en el programa de hibridación interespecífica entre L. cicera y L. sativus reduciendo así el número de plantas a analizar mediante hibridación in situ y aumentando la eficiencia del programa.
El análisis GISH de las plantas de las generaciones F4 y F5 procedentes del cruzamiento L. cicera x L. sativus, permitió distinguir la cromatina de las líneas parentales presente en estas plantas. Sin embargo, el análisis GISH de las plantas de la generación F2 provenientes del cruzamiento P. sativum subsp. sativum x P. fulvum, no permitió identificar la cromatina proveniente de las líneas parentales. Estos resultados sugieren que la distancia genética entre L. cicera y L. sativus puede ser mayor que la que separa a P. sativum subsp. sativum de P. fulvum Se ha establecido la localización física de la secuencia 5S en P. fulvum lo que proporciona nuevos marcadores citogenéticos en esta especie.
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