RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Da El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. introducción o motivación de la tesis El objetivo general de esta tesis es el desarrollo y puesta a punto de nuevos métodos de análisis aplicables a componentes de calidad del aceite en semillas oleaginosas como contenido y perfil de fitoesteroles, la utilización de espectroscopía infrarroja cercana NIRS (Near Infrared Spectroscopy) para composición en ácidos grasos y la caracterización de un nuevo aceite de cártamo con perfil de tocoferoles modificados. Los métodos se han aplicado para cuatro especies: girasol, cártamo, ricino y almendro. Además, se describen los componentes de calidad del aceite, la importancia económica de las especies utilizadas y las técnicas de análisis utilizadas para su evaluación. La calidad de los aceites vegetales se refiere a las propiedades nutricionales y funcionales del aceite (Fernández-Martínez et al., 2004). No existe una calidad óptima de un aceite ya que esta depende de su uso específico (Velasco y Fernández-Martínez, 2002). Los principales parámetros que determinan la calidad de su aceite son la composición de ácidos grasos y la presencia de componentes minoritarios como tocoferoles y fitoesteroles (Velasco y Fernández- Martínez, 2002; Fernández-Martínez et al., 2006). De acuerdo con lo mencionado, la mejora de calidad de su aceite se basa en la modificación de la composición de dichos componentes que intervienen en la calidad.
Los ácidos grasos son largas cadenas hidrocarbonatadas con un número par de átomos de carbono y con un grupo carboxilo terminal. La mayoría se encuentran formando parte de los triacilgliceroles (Voet et al., 2007). Los triacilgliceroles son moléculas de glicerol cuyos tres grupos hidroxilo se hallan esterificados con ácidos grasos y se identifican según la ubicación de los mismos. Los tocoferoles son compuestos liposolubles que junto a los tocotrienoles y el plastocromanol-8 forman parte de un grupo amplio de moléculas químicas denominadas tococromanoles (Kamal-Eldin, 2005). Son moléculas de naturaleza anfipática cuya estructura está 1 formada por dos partes, una polar que es el anillo cromano formado por un ciclo fenólico y un heterociclo con un átomo de O, y otra apolar que es una larga cadena isoprenoide denominada fitil (Caretto et al., 2010). Los tocoferoles poseen una cadena fitil saturada mientras que los tocotrienoles la presentan insaturada con 3 dobles enlaces (Brigelius-Flohé et al., 2002). Según la posición y numero de los grupos metilo (-CH3) que ocupan el anillo de cromano, existen diferentes tipos de tocoferoles y tocotrienoles. Los fitoesteroles son triterpenos de origen vegetal presentes en las semillas y frutos oleaginosos. Se caracterizan por poseer una estructura química semejante al colesterol. En su síntesis interviene el escualeno que actúa como intermediario. Regulan la fluidez y la permeabilidad de las membranas celulares de las plantas de forma similar a la del colesterol en las membranas de las células de los mamíferos (Hartmann, 1998).
La mejora genética de las plantas oleaginosas para contenido de aceite y componentes de calidad requiere la evaluación de la variación existente en colecciones de germoplasma de las distintas especies y de la obtenida por mutagénesis, así como de la evaluación de poblaciones segregantes en los programas de mejora. Esto precisa del análisis de un número elevado de muestras con objeto de identificar genotipos con la composición alterada (Velasco y Fernández-Martínez, 2002). Un requisito indispensable para esta evaluación, es el desarrollo de métodos rápidos, fiables y no destructivos. En cuanto a los componentes de calidad, como perfil de ácidos grasos y tocoferoles, un factor a considerar es que estos suelen estar controlados por el genotipo del embrión (Velasco y Fernández-Martínez, 2002) y para llevar a cabo la selección es importante el análisis de semillas individuales siempre que se puedan analizar de forma no destructiva. Esto es posible utilizando la técnica de la media semilla que consiste en el análisis de una porción de la semilla distal al embrión y sembrar la otra mitad. Las técnicas instrumentales utilizadas para esta tesis son cromatografía, estimación de la estabilidad oxidativa mediante el método Rancimat y espectroscopía infrarrojo cercana.
La cromatografía es una técnica de análisis químico basada en el principio de adsorción selectiva, que es la retención física o química de las sustancias de una mezcla en los sitios activos de la superficie de un sólido o de un líquido dispuesto sobre otro sólido que actúa como soporte (Cela et al., 2002). El sólido ó líquido, en donde se retienen las sustancias, constituye la fase estacionaria. La mezcla de las sustancias viaja a través de un fluido que constituye la fase móvil.
En cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa fina de gel de sílice con propiedades adsorbentes, dispuestas sobre un soporte poroso que denominamos placa. La fase móvil será la mezcla de disolventes adecuada. La sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria y se 2 moverá con la fase móvil que subirá por capilaridad e irá arrastrando a las moléculas de la mezcla que se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria y según la polaridad.
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica para separar compuestos con baja volatilidad. El régimen de trabajo se lleva a cabo a través de dos formas (Willard et al., 1988). En el régimen de fase normal, la fase móvil es apolar (pentano, hexano, heptano, diclorometano, etc) y la fase estacionaria es polar (ej: gel de sílice). En dicho régimen los compuestos más apolares se retienen menos en la fase estacionaria y salen antes arrastrados por la fase móvil. Lo contrario ocurre en el régimen de fase reversa, donde la fase móvil es polar y la fase estacionaria es apolar. Es muy común emplear mezclas de más de una fase móvil con objeto de aumentar la selectividad en la separación. La columna contiene el material de relleno necesario para separar los compuestos esperados (fase estacionaria).
Al igual que HPLC, la cromatografía de gases es también un método de alta resolución (McNair et al., 2009). La diferencia más importante es que CG solo puede hacer frente a sustancias volátiles, con temperaturas de ebullición inferiores a 350oC, o muestras que puedan ser derivatizadas en un producto con punto de vaporización a estas temperaturas. Además, los analitos deben ser estables a dichas temperaturas. En cromatografía de gases, la fase móvil, que está en estado gaseoso y que se le denomina gas portador, transporta al analito a lo largo de a columna (Harris, 2007). Los gases portadores deben ser inertes con la fase estacionaria y con los analitos.
La estabilidad oxidativa se define como la resistencia a la oxidación bajo condiciones establecidas (Guillén y Nerea, 2002; Velasco et al., 2004). Se suele estimar mediante el uso de pruebas aceleradas, donde el suministro de oxígeno y las elevadas temperaturas empleadas, permiten una alteración más rápida (Guillén y Nerea 2002; Lee et al., 2004). El método Rancimat permite estimar la estabilidad oxidativa mediante la determinación del período de inducción (PI), que es el tiempo a partir del cual se empiezan a detectar cambios en la calidad del aceite debido al inicio de las reacciones de oxidación (Velasco et al., 2004; Gonzaga y Celio, 2006). Se produce la oxidación acelerada de la muestra y el registro constante de los cambios en la conductividad eléctrica del agua, que recoge los compuestos volátiles formados durante la reacción.
La Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano (NIRS) es una técnica precisa y reproducible para el análisis cualitativo y cuantitativo en la industria agroalimentaria, farmacéutica, química, en medicina, medio ambiente, etc. (Osborne et al., 1993; Williams, 2001; McLure, 2003; Batten 2004).
La técnica NIRS presenta las siguientes ventajas: 1) es una técnica no destructiva; 2) es respetuosa 3 con el medioambiente; 3) requiere poca (secado y molienda) o ninguna preparación de las muestras; 4) posibilita analizar simultáneamente varios constituyentes para cada muestra; 5) es flexible; 6) el coste operacional se reduce respecto a los métodos convencionales; 7) es simple en cuanto a su uso (Obiols, 1997; Williams y Norris, 2001; Robert et al., 2004; Siesler et al., 2006). Sin embargo, la técnica de NIRS presenta algunas dificultades. Uno de los problemas es el manejo de gran cantidad de datos espectrales obtenidos en una aplicación NIRS que a menudo son redundantes, debido a solapamientos de las bandas de absorbancia, lo que hace muy difícil la interpretación de los resultados. Para solucionar este problema, se ha recurrido al empleo de algoritmos matemáticos para el tratamiento de la información espectral (Kaffka y Gyamarti, 1995; Jouan-Rimbaud y Massart, 1996). Otra dificultad es la de ser un método secundario que necesita un método de referencia oficial para relacionar la información espectral con los parámetros cuantitativos y cualitativos de interés (Shenk et al., 1992; Shenk y Westerhaus 1995; Weyer, 1995).
2.-contenido de la investigación 1. Puesta a punto y validación de un método para el análisis de fitoesteroles en semillas de girasol.
2. Identificación de semillas alto oleico en ricino mediante espectroscopía por reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS).
3. Uso de la espectroscopia de infrarrojo cercano para el análisis del contenido en aceite y perfil de ácidos grasos en harina de almendras.
4. Caracterización química y estabilidad oxidativa de aceites de cártamo alto oleico con niveles elevados de gamma-tocoferol.
3.-Conclusión Con el objetivo del desarrollo y puesta a punto de nuevos métodos de análisis aplicables a componentes de calidad del aceite en distintas semillas oleaginosas, en esta tesis se han alcanzado las siguientes conclusiones: 1.- Se ha desarrollado y validado un método para el análisis de fitoesteroles en muestras pequeñas de semillas de girasol, adaptando previos métodos publicados.
1.1 Los resultados de este estudio demuestran que el análisis del contenido y composición de fitoesteroles puede llevarse a cabo en pequeñas muestras de semillas lo que facilita la 4 selección en programas de mejora genética para este carácter.
1.2 La comparación de este método con el método estándar, utilizando la extracción previa del aceite, muestra una alta correlación (r = 0,85) entre ambos métodos.
1.3 La aplicación del método desarrollado a una colección de 87 líneas puras de girasol ha puesto de manifiesto una gran variación del contenido de fitoesteroles, de 1426 a 4710 mg/kg en la semilla y 2855 a 9752 mg/kg en el aceite, que es mayor que la observada en otros estudios.
2.- Se ha puesto a punto un método basado en la utilización de Espectroscopía Infrarroja Cercana (Near Infrared Spectroscopy, NIRS) y Análisis Discriminante Lineal (Linear Discriminant Analysis, LDA) para la discriminación entre semillas con alto contenido en oleico de semillas con alto contenido en ricinoleico.
2.1 Se ha demostrado que esta técnica constituye un medio efectivo, rápido y no destructivo para la discriminación de semillas de ricino con alto contenido en ácido oleico y semillas con alto contenido en ácido ricinoleico.
2.2 La discriminación por NIRS de ambos tipos de semillas está basada principalmente en regiones espectrales entre 1400 y 1914 nm asociadas con la presencia del grupo OH en la molécula de ácido ricinoleico.
3.- Se ha demostrado que la técnica NIRS también puede ser utilizada con precisión para el análisis de contenido de aceite y la concentración de los ácidos oleico y linoleico en muestras de harina de almendras.
3.1 La discriminación por NIRS de estos caracteres en la almendra está basada principalmente en regiones espectrales entre 2240 y 2380 nm.
3.2 La precisión para el análisis de la contenido concentración de los ácidos saturados, palmítico y esteárico, fue baja posiblemente por la escasa variación existente para esto ácidos grasos en el germoplasma de almendra.
4.- Se han evaluado las características funcionales de un nuevo aceite de cártamo con alto contenido en ácido oleico y ¿-tocoferol 4.1 Este nuevo aceite presentó una mayor estabilidad oxidativa que el aceite alto oleico 5 convencional, con alto contenido en ¿-tocoferol.
4.2 El análisis de la termoestabilidad del aceite de cártamo extraído mediante presión, evaluada mediante el método de Rancimat fue inferior que para los aceites extraídos con disolvente.
En particular, se obtuvieron valores de 38.0 h en el caso del aceite con alto contenido en ácido oleico y ¿-tocoferol, frente a 66,4 h en el caso del aceite con alto contenido en ácido oleico y ¿-tocoferol. Para los aceites extraídos con disolvente, estos valores fueron de 32.0 h y 121.0 h respectivamente 4.3 Estos resultados demuestran que el nuevo aceite de cártamo, con alto contenido en ácido oleico y gamma tocoferol es muy adecuado para diversas aplicaciones tales como frituras, biolubricantes y biocombustibles.
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