A study of the role of KEA1 and KEA2 K+/H+ antiporters in chloroplast development and division in arabidopsis thaliana
- Autores: Ali Aboukila
- Directores de la Tesis: Maria Pilar Rodríguez Rosales (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Antonio Fernández García (presid.), Juan Manuel Ruiz Sáez (secret.), Francisco Javier Quintero Toscano (voc.), Andres Belver Cano (voc.), María de las Nieves Aranda Sicilia (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Fundamental y de Sistemas por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
El potasio (K+) es un nutriente esencial para la producción y calidad de los cultivos. La esencialidad del K+ como nutriente radica en su papel clave en multitud de procesos celulares, siendo determinante en los procesos de turgor y expansión celular, los movimientos de la hoja, la apertura y cierre estomático, el crecimiento axial y los tropismos (Marschner, 1995; Shabala, 2003). El K+ es transportado a través de la membrana plasmática y membranas intracelulares, siendo fundamental para la regulación del potencial de membrana (Dreyer and Uozumi, 2011; Shabala, 2003). En cloroplastos, el acoplamiento del transporte de K+ a los flujos de H+ inducidos por la luz es de gran importancia para un eficiente proceso fotosintético (Carraretto et al., 2013; Armbruster et al., 2014; Kunz et al., 2014). El K+ además interviene en el proceso de carga de fotoasimilados al floema (Ache et al., 2001; Gajdanowicz et al., 2011) y modula la actividad de más de 70 enzimas (Marschner, 1995). La absorción, transporte y homeostasis de K+ juega un papel esencial en la respuesta de tolerancia a estreses abióticos como salinidad, sequía o altas temperaturas. Bajo estrés salino el Na+ compite con el K+ para su absorción por la raíz. En estas condiciones los niveles de transcrito de varios genes que codifican para transportadores de K+ pueden verse incrementados o disminuidos, lo que probablemente refleja la diferente capacidad de las distintas especies de plantas para mantener la absorción de K+ en condiciones de salinidad (Zhu, 2003). La inhibición de la fotosíntesis es uno de los parámetros que mejor evidencia el efecto negativo que ejercen estreses abióticos como salinidad, sequía o altas temperaturas sobre la producción de los cultivos, habiéndose demostrado que un adecuado suministro de K+ puede paliar estos efectos negativos de los estreses abióticos sobre la fotosíntesis (Ashraf and Harris, 2013). En este contexto, la identificación y estudio de los genes que codifican para transportadores de K+ del cloroplasto puede ser importante para incrementar la tolerancia a la salinidad o sequía, así como la eficiencia en el uso de nutrientes y agua en plantas de interés agronómico mediante sobrexpresión de estos genes (Rodríguez-Rosales et al., 2009).
Los antiportadores cation/proton acoplan gradientes de pH al transporte de cationes regulando de esa forma el balance osmótico, el pH y el contenido intracelular en cationes. Estas características les confieren un importante papel en la tolerancia a la salinidad o sequía. Las proteínas de la familia CPA (Cation/Proton Antiporter) se agrupan en las subfamilias CPA1 y CPA2 y catalizan el intercambio de Na+ o K+ contra H+ a través de las membranas celulares. Los transportadores iónicos de la familia CPA1 incluyen a los antiportadores (K+, Na+)/H+ NHX; mientras que los transportadores de la familia CPA2 incluyen a las proteínas CHX y KEA. En Arabidopsis thaliana, las proteínas AtKEA1–3 muestran homología a los transportadores bacterianos de eflujo de K+, Kef. AtKEA1 y AtKEA2 han adquirido un dominio extra hidrofílico de unos 500 residuos en el extremo Nterminal (Aranda-Sicilia et al., 2012; Chanroj et al., 2012). En el laboratorio en que se realizó esta tesis se ha demostrado que algunos antiportadores K+/H+ de la familia KEA de Arabidopsis thaliana etán localizados en las membranas del cloroplasto (Aranda-Sicilia et al., 2012), lo que posteriormente ha sido confirmado por otros estudios (Armbruster et al., 2014; Kunz et al., 2014). Los cloroplastos de las plantas y las algas se originaron a partir de un evento endosimbiótico que probablemente implicó a un organismo procariota fotoautotrófico ancestral. Tanto los cloroplastos como las cianobacterias tienen membranas tilacoidales portadoras de complejos pigmentos-proteínas que intervienen en las reacciones oxigénicas de la fotosíntesis dependientes de la luz (Pfeil et al., 2014). En plantas, los plastidios se han convertido en complejas organelas que están integradas en la célula vegetal hospedadora donde se diferencian y dividen a la vez que se produce la diferenciación y desarrollo de la planta (Basak and Moller, 2013). Aunque los genes que codifican las proteínas AtKEA1, 2 y 3 tienen su origen en cianobacterias, han sido transferidos al genoma nuclear de Arabidopsis. En el balance osmótico del cloroplasto el K+ desempeña un papel fundamental. El bombeo de protones inducido por la luz en el lumen tilacoidal es eléctricamente compensado por el eflujo de K+ desde el tilacoide (Carraretto et al., 2013). El alto pH estromático resultante es necesario para el óptimo funcionamiento de las enzimas del ciclo de reducción del carbono fotosintético. El mantenimiento de la homeostasis de K+ y H+ en el estroma depende del intercambio K+/H+ en la membrana interna (Peters and Berkowitz, 1991; Berkowitz and Peters, 1993; Wang et al., 1993). Por otra parte, las reacciones fotosintéticas son sensibles a los cambios de volumen del cloroplasto, que pueden ser inducidos por luz, estrés osmótico o déficit hídrico y los cloroplastos pueden regular de forma rápida el potencial osmótico mediante intercambio de solutos orgánicos y K+ (Nobel, 1968; Nobel, 1969; Robinson, 1985; and Berkowitz, 1988; Gupta et al., 1989; McCain, 1995). Sin embargo, las bases moleculares que median estos flujos iónicos son en gran medida desconocidas. En esta tesis hemos estudiado el efecto de la disrupción de los genes AtKEA1 y AtKEA2 usando mutantes insercionales T-DNA obtenidos de las colecciones SALK y SAIL. De acuerdo a un publicación reciente (Kunz et al., 2014), AtKEA1 y AtKEA2 son fundamentales para el balance osmótico y la integridad del cloroplasto. Hemos encontrado, sin embargo, que la disrupción de AtKEA1 y AtKEA2 compromete sobre todo el desarrollo y división del cloroplasto. Mientras que los mutantes simples atkea1 o atkea2 son indistinguibles de las plantas WT, los mutantes dobles atkea1atkea2 presentan una coloración amarillo pálido, muestran una inhibición del crecimiento y una reducción de la fotosíntesis en las hojas jóvenes en desarrollo. Este fenotipo es típico de los mutantes virescentes que están afectados de forma general en la biogénesis de cloroplastos (Jarvis and López-Juez, 2013). En este sentido, las plantas dobles mutantes muestran un desarrollo defectuoso de las membranas tilacoidales. Hemos constatado que la proteína AtKEA2-GFP se localiza específicamente en los polos de los cloroplastos jóvenes y en división, pero excluida del lugar de división, una localización que es dependiente del dominio N-terminal. Además, hemos observado que las plantas dobles mutantes tienen una menor cantidad de cloroplastos. Además de la importancia obvia que tiene la mejora de la eficiencia fotosintética en condiciones de estrés abiótico para la producción de los cultivos, el estudio de la división y desarrollo de los cloroplastos tiene impacto en el ámbito agrícola. En este sentido, se considera que la capacidad para manipular el tamaño de los plastidios puede tener implicaciones en el control de las dimensiones de los gránulos de almidón. Se ha demostrado en patata que las proteínas FtsZ del anillo de división de los cloroplastos juegan un papel determinante en el tamaño de amiloplastos y, en consecuencia, en el tamaño de los gránulos de almidón (de Pater et al., 2006), lo cual puede tener gran importancia desde el punto de vista comercial (Gutierrez et al., 2002).
El OBJETIVO GENERAL de este trabajo ha sido estudiar la función fisiológica de las proteínas AtKEA1 y AtKEA2 de Arabidopsis thaliana. Para ello se ha analizado el fenotipo de mutantes T-DNA simples y dobles, determinado la localización subcelular de AtKEA2 y estudiado la función del extremo N-terminal de AtKEA2 mediante expresión heteróloga en levadura y aproximaciones bioinformáticas. Este objetivo general se ha desarrollado en los siguientes objetivos específicos: 1.- Análisis fenotípico de mutantes simples y dobles. Se identificaron mutantes insercionales T-DNA de AtKEA1 (cromosoma 1) y AtKEA2 (cromosoma 4) (http://Arabidopsis thaliana .org/index.jsp/) y se obtuvieron semillas de dichos mutantes que fueron suministradas por NASC. Se generaron dobles mutantes mediante cruzamientos de los mutantes simples y se analizaron sus fenotipos en condiciones normales de crecimiento y en respuesta a los estreses salino y osmótico, así como a la intensidad luminosa. Se determinaron parámetros fotosintéticos y contenidos en pigmentos y proteínas de la membrana del cloroplasto. 2.- Análisis del número, morfología y ultraestructura del cloroplasto. Al objeto de determinar el papel de AtKEA1 y AtKEA2 en el desarrollo y división de cloroplastos, se analizó el tamaño y número de cloroplastos mediante microscopía óptica en hojas enteras o en células del mesófilo foliar aisladas y fijadas. También se llevó a cabo un estudio detallado de la ultraestructura del cloroplasto mediante microscopía electrónica de transmisión. 3.- Análisis de la localización subcelular de AtKEA2. Se generó una construcción codificante de la proteína AtKEA2 completa fusionada al extremo C-terminal de GFP. La fluorescencia de GFP se estudió por microscopía confocal en células jóvenes del mesófilo foliar o en cloroplastos aislados. La expresión específica de AtKEA1 y AtKEA2 a nivel de diferentes tejidos se estudió por RT-PCR.
4.- Estudio de la interacción de AtKEA2 con las proteínas de división del cloroplasto. Para determinar si AtKEA2 se asocia a la maquinaria de división del cloroplasto, se purificó AtKEA2-GFP a partir de extractos de proteínas de cloroplastos utilizando para ello un dispositivo de bolas magnéticas acopladas a proteínas de unión a GFP. La copurificación de las proteínas de división del cloroplasto FtsZ1 y 2 con AtKEA2-GFP se ensayó utilizando anticuerpos policlonales. 5.- Análisis bioinformático y bioquímico del dominio N-Terminal. El dominio Nterminal de AtKEA2 así como de varios mutantes de delección de AtKEA2 se expresó en levadura para determinar los aminoácidos implicados en la interacción con la membrana. Estas interacciones se estudiaron en membranas de levadura aisladas y tratadas con agentes caotrópicos o detergentes. Las relaciones filogenéticas y la estructura 3D se predijeron utilizando sistemas de predicción y modelización disponibles online. Los resultados obtenidos de esta investigación han dado lugar a siguientes conclusiones: 1. AtKEA1 y AtKEA2 son antiportadores Catión/Protón de la membrana interna del cloroplasto presentes en la mayor parte de los tejidos de la parte aérea de la planta. Contrariamente a los dobles mutantes atkea1atkea2, los mutantes simples atkea1 o atkea2 no muestran un fenotipo distinguible del silvestre, lo que indica la función redundante de las proteínas AtKEA1 y AtKEA2. 2. Las plantas dobles mutantes atkea1atkea2 presentan un tamaño pequeño y un aspecto clorótico en los estadios iniciales del desarrollo. El aspecto clorótico de las hojas se manifiesta en la zona de proliferación, mientras que en las zonas maduras y de expansión se recupera la pigmentación. Este fenotipo es típico de los mutantes virescentes, generalmente afectados en la biogénesis del cloroplasto. 3. AtKEA1 y AtKEA2 tienen un papel en la biogénesis del cloroplasto, la formación de la membrana tilacoidal y la división del cloroplasto. Los cloroplastos de las hojas jóvenes de los dobles mutantes presentan un aspecto hinchado con membranas tilacoidales desorganizadas y menos apiladas y muestran una drástica reducción en el contenido de proteínas y pigmentos fotosintéticos. Las hojas jóvenes de los dobles mutantes presentan un menor número de cloroplastos así como una reducción de la actividad fotosintética.
4. AtKEA2 presenta un largo extremo N-terminal con dominios que adoptan conformaciones coiled-coil, mostrando homología a un regulador de la división celular en bacterias. El extremo N-terminal juega un papel esencial en la función fisiológica de KEA2 en Arabidopsis. 5. AtKEA2 se localiza específicamente en los polos de los cloroplastos jóvenes en división. Esta localización está determinada por el extremo N-terminal de AtKEA2. Se ha demostrado en levadura que el extremo N-terminal de la proteína AtKEA2 se une fuertemente a membrana. 6. La localización de AtKEA2 en los polos de cloroplastos jóvenes o en microdominios de la membrana interna de cloroplastos maduros sugiere que estas localizaciones tienen un papel esencial en la formación de la membrana tilacoidal.
