Gene editing in hematopoietic stem cells: A potential therapeutic approach for Fanconi anemia
- Autores: Begoña Diez Cabezas
- Directores de la Tesis: Juan Antonio Bueren Roncero (codir. tes.), Paula Río Galdo (codir. tes.), Maria Jose Hazen de San Juan (tut. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Fernández Piqueras (presid.), Raúl Torres Ruiz (secret.), Pietro Genovese (voc.), Antonio Bernad Miana (voc.), Jordi Surrallés Calonge (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
La terapia génica constituye hoy en día una alternativa segura y eficaz para el tratamiento de determinadas enfermedades monogénicas que afectan al sistema hematopoyético. Sin embargo, puesto que el riesgo de mutagénesis insercional debido al uso de vectores integrativos no se puede descartar completamente, la terapia génica de edición se ha propuesto como una alternativa más segura, ya que la inserción del gen terapéutico está dirigida a un locus específico del genoma. Las aproximaciones de edición génica se basan en el uso de nucleasas específicas que generan roturas de doble cadena en un sitio específico del genoma, mejorando así la eficacia de la recombinación homóloga con construcciones donadoras que albergan el gen de interés flanqueado por los brazos de homología correspondientes. En este estudio se han optimizado las condiciones para editar líneas celulares linfoblastoides (LCLs) y células madre hematopoyéticas (CMHs), inicialmente de donantes sanos, con el objetivo final de corregir mediante terapia génica de edición las progenitores hematopoyéticos de pacientes con anemia de Fanconi del subtipo A (AF-A).
En particular, hemos establecido un método eficaz para editar LCLs y CMHs en un sitio seguro en el genoma, el locus AAVS1. Nuestro protocolo se basa en la transducción de estas células con vectores lentivirales defectivos en integración que portan un donador con el gen de interés, seguido de la nucleofección de estas células con nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) utilizadas como ARNm. Utilizando un vector donador control que lleva el gen marcador GFP hemos logrado una eficiencia media de corrección génica dirigida en células CD34+ de donantes sanos del 9,43%. Por otra parte, hemos confirmado que la edición génica también es eficaz en CMHs multipotentes con capacidad de repoblación a largo plazo en ratones inmunodeficientes. Para mejorar la eficacia de la edición génica, hemos investigado la posibilidad de utilizar nanopartículas de oro, que incrementaron la eficiencia de transducción de vectores lentivirales integrativos y no integrativos en las células CD34+. Sin embargo, este incremento no dio lugar a una mejora en la edición génica, debido a la toxicidad asociada a la nucleofección de las células tratadas con las nanopartículas. A continuación, mediante el uso de un vector donador terapéutico, portador del gen FANCA, hemos demostrado la corrección del fenotipo de LCLs de pacientes con AF-A mediante edición génica, que confirmamos por la formación de focos de reparación de FANCD2 y la reversión de la sensibilidad de estas células frente a un agente entrecruzante del ADN, tal como mitomicina C (MMC). Para mejorar la eficacia de edición génica en células hematopoyéticas de pacientes AF-A, también investigamos el efecto mediado por la inhibición transitoria de la anti-recombinasa PARI. Aunque la inhibición de PARI aumentó los focos de reparación de RAD51, no observamos aumento significativo en la eficiencia de la edición génica. Por último, hemos demostrado que nuestro protocolo de edición génica también permite, aunque con menor eficacia, la inserción del gen terapéutico en progenitores hematopoyéticos de pacientes con AF-A, permitiendo así la reversión parcial de su sensibilidad a MMC.
Nuestro estudio demuestra por primera vez que la terapia génica de edición en el locus seguro AAVS1 es factible en las células hematopoyéticas, incluyendo progenitores hematopoyéticos primarios, de pacientes con anemia de Fanconi del subtipo A, abriendo nuevas perspectivas para la terapia génica dirigida de esta enfermedad, así como de otras enfermedades monogénicas del sistema hematopoyético.
