Estudio de la influencia del proceso de preservación y de la centrifugación coloidal sobre la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas identificadas en el semen canino
- Autores: Mª José Gálvez Lagares
- Directores de la Tesis: Manuel Hidalgo Prieto (dir. tes.), Jesús Manuel Dorado Martín (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Inmaculada Rodríguez Artiles (presid.), Xiomara Lucas Arjona (secret.), Julián Santiago Moreno (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE Da Ma José Gálvez Lagares El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral.
El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. INTRODUCCIÓN O MOTIVACIÓN DE LA TESIS La preservación del semen, mediante refrigeración o congelación, constituye una parte integral de las técnicas de reproducción asistida en la especie canina (Kim et al., 2010). Sin embargo, los cambios de temperatura producidos durante los procesos de refrigeración y criopreservación provocan daños estructurales, a veces irreversibles, sobre los espermatozoides (Watson, 2000). En este sentido, nace la necesidad de mejorar los procesos de preservación del semen canino e investigar nuevos procedimientos que permitan optimizar la calidad seminal del mismo.
En la última década se han desarrollado una amplia variedad de métodos para la selección de espermatozoides (Morrell and Rodriguez-Martinez, 2011). Las técnicas empleadas hasta la fecha para la selección de espermatozoides de perro incluyen la centrifugación simple (lavado) (Rijsselaere et al., 2002), la migración vertical o swim-up (Bukowska et al., 2011; Sánchez et al., 2011) la centrifugación en gradientes de densidad (Dorado et al., 2011; Phillips et al., 2012) o en una sola capa de coloide también descrito como Single Layer Centrifugation (SLC) (Morrell et al., 2008a; Dorado et al., 2013) y la filtración a través de fibra de vidrio (Kim et al., 2010).
En perros, la centrifugación simple se emplea para eliminar la fracción prostática del eyaculado, la cual es inadecuada para la preservación del semen a 4oC (Rijsselaere et al., 2002), y es uno de los pasos del proceso de congelación del esperma canino (Rota et al., 2007). En cambio, esta técnica no mejora la calidad seminal de la muestra, al concentrar en el pellet todos los espermatozoides presentes en la muestra original.
Los métodos de selección de espermatozoides como la técnica de swim-up o la centrifugación coloidal podrían ser útiles en la mejora de los protocolos de preservación (refrigeración y congelación) del esperma de perro. Entre los coloides actualmente desarrollados, AndrocollTM fue desarrollado para separar espermatozoides móviles, con la cromatina intacta y morfológicamente normales del resto del eyaculado (Morrell et al., 2009). Así, ha sido utilizado satisfactoriamente en el procesado de muestras seminales de diferentes especies animales (Thys et al., 2009; Chatdarong et al., 2010; Morrell et al., 2010; Jiménez-Rabadán et al., 2012; Ortiz et al., 2013). En la especie canina, ha sido empleado también con buenos resultados en el procesado de muestras de semen refrigerado (Morrell et al., 2008b) y congelado (Morrell, 2013). Por lo expuesto, la centrifugación coloidal a través del coloide Androcoll-C, específico de la especie canina, podría ser una alternativa eficaz para mejorar la calidad seminal del esperma de perro refrigerado y congelado.
Por otro lado, el método de swim-up se ha empleado frecuentemente para la selección de espermatozoides móviles (Rodriguez-Martinez et al., 1997); no obstante, la tasa de recuperación de esta técnica es reducida. Para optimizar sus resultados, se ha desarrollado una nueva técnica alternativa, sin centrifugación, que emplea el coloide Androcoll-C como filtro y reduce el protocolo a un solo paso. No se han realizado hasta la fecha estudios que comparen la eficacia de estas tres técnicas en el procesado del semen de perro antes de la refrigeración.
Actualmente, la identificación de subpoblaciones de espermatozoides móviles dentro de un mismo eyaculado de mamíferos se ha convertido en un tema de máximo interés, considerándose el eyaculado como una población heterogénea (Mortimer, 2000).
La presencia de estas subpoblaciones en el eyaculado de perro se ha relacionado previamente con la resistencia a la criopreservación (Dorado et al., 2011). No obstante, según nuestro conocimiento, no se han realizado hasta la fecha estudios que estudien la influencia de la centrifugación del semen canino refrigerado o crioconservado a través del coloide Androcoll-C sobre la estructura de las subpoblaciones cinéticas.
Por lo expuesto, los objetivos de esta Tesis Doctoral fueron: (1) evaluar los efectos de la refrigeración del esperma canino en un diluyente comercial conteniendo diferentes concentraciones de yema de huevo (20% versus 10%) sobre la distribución de los espermatozoides dentro de las diferentes subpoblaciones cinéticas identificadas; (2) evaluar el efecto de la selección con Androcoll-C sobre la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma de perro refrigerado, cuando la centrifugación coloidal se realiza antes o después de la refrigeración o cuando las muestras son sometidas a doble centrifugación coloidal (antes y después del proceso de refrigeración); (3) evaluar la influencia del proceso de crioconservación y de la centrifugación a través del coloide Androcoll-C sobre la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma de perro crioconservado; y (4) comparar la eficacia de la centrifugación simple, la centrifugación en una sola capa de Androcoll-C y un método swim-up modificado con Androcoll-C en el procesado del semen de perro refrigerado, en base a la calidad seminal tras 72 horas de refrigeración.
2. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN La preservación del semen constituye una parte fundamental dentro de los programas de reproducción asistida en perros; sin embargo, es un proceso que compromete la fertilidad potencial del mismo. En este sentido, las técnicas de selección espermática actuales nos permiten mejorar la calidad seminal tanto de eyaculados como de muestras procesadas, obteniéndose como resultado final una muestra de esperma con una buena capacidad fecundante. La presente Tesis Doctoral se compone de cuatro estudios experimentales. El primero (primera publicación) evaluó la influencia del proceso de refrigeración y la adición de diferentes concentraciones de yema de huevo sobre la estructura subpoblacional del semen de perro. El segundo (segunda publicación), trató de evaluar el efecto de la centrifugación coloidal en una sola capa del coloide Androcoll-C, antes y después de la refrigeración, sobre la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma canino refrigerado. En el tercer estudio (tercera publicación) se comprobó la influencia del proceso de crioconservación y de la centrifugación coloidal a través de Androcoll-C en la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma crioconservado de perro. Por último, un cuarto estudio (cuarta publicación) comparó la eficacia de las técnicas de centrifugación simple, centrifugación en una sola capa de Androcoll-C y swim-up modificado con Androcoll-C para el procesado del semen de perro antes de su refrigeración. Durante el periodo experimental se emplearon un total de 9 perros adultos y sanos de diferentes razas (2 Galgos españoles, 1 Braco alemán, 1 mestizo, 4 Beagles y 1 West Highland white terrier).
Un total de 78 eyaculados fueron recolectados, 1 ó 2 veces por semana mediante manipulación digital, conservándose la fracción espermática. Según experimentos, las muestras seminales: (i) inmediatamente después de la recogida, (ii) tras la refrigeración o descongelación y (iii) después del proceso de selección espermática, fueron evaluadas para el movimiento espermático, la morfología y la integridad de la membrana espermática y del acrosoma. Finalmente, empleando un análisis clúster multivariante, los espermatozoides fueron clasificados y agrupados en un número reducido de subpoblaciones, de acuerdo a su patrón cinético.
En la primera publicación, las muestras seminales (n = 20) fueron refrigeradas siguiendo un protocolo estándar y empleando un diluyente comercial a base de Tris-ácido cítrico suplementado con un 20% o un 10% de yema de huevo. Los parámetros de calidad espermática fueron evaluados en las muestras seminales frescas y tras 24 y 72 h de refrigeración. Mediante análisis clúster multivariante clasificamos 54.261 espermatozoides móviles en cuatro subpoblaciones (sP) cinéticas (sP1: espermatozoides poco activos y no progresivos; sP2: espermatozoides lentos y con escasa linealidad; sP3: espermatozoides muy activos y progresivos; sP4: espermatozoides muy activos pero no progresivos. La refrigeración afectó significativamente (P < 0,05) a la distribución de los espermatozoides dentro de cada subpoblación así como a los parámetros cinéticos de las mismas. sP1 y sP2 disminuyeron significativamente (P < 0,001) durante el proceso de refrigeración, mientras que sP3 y sP4 aumentaron significativamente (P < 0,05). sP3 fue observada más frecuentemente en las muestras procesadas con un 20% de yema de huevo a las 24 y 72h del proceso de refrigeración.
En la segunda publicación se valoró la influencia del SLC sobre la calidad seminal, cuando ésta se realiza antes y después del proceso de refrigeración o cuando se aplica una doble SLC (antes y después de la refrigeración). Las muestras seminales (n = 20) fueron divididas en 4 alícuotas: (i) no seleccionadas: no se realizó SLC; (ii) SLC-PC: la selección se realizó antes del proceso de refrigeración; (iii) SLC-AC: la selección se realizó después del proceso de refrigeración; (iv) doble SLC: la selección se realizó antes y después del proceso de refrigeración. Los parámetros de calidad espermática se valoraron en todas las muestras seminales procesadas (i, ii, iii, iv) tras 72 h de refrigeración.
El análisis clúster clasificó 55.138 espermatozoides en cuatro subpoblaciones cinéticas (sP1: espermatozoides muy activos pero no progresivos; sP2: espermatozoides lentos pero muy progresivos; sP3: espermatozoides poco activos y no progresivos; sP4: espermatozoides muy activos y progresivos). Por otra parte, las muestras seleccionadas tras el proceso de refrigeración fueron enriquecidas en la subpoblación sP4, alcanzando proporciones del 28,2%. La mayoría de los parámetros evaluados mostraron valores superiores (P < 0.05) en las muestras SLC-AC En la tercera publicación, las muestras seminales (n = 20) fueron crioconservadas empleando un protocolo estándar de congelación y, tras su descongelación, fueron divididas en dos alícuotas: (i) muestras no seleccionadas (control); (ii) muestras seleccionadas (centrifugadas a través del coloide Androcoll-C). Los parámetros de calidad espermática se valoraron en las muestras de semen fresco, seleccionadas y no seleccionadas. El análisis clúster multivariante separó 57.577 espermatozoides en tres subpoblaciones cinéticas (sP1: espermatozoides poco activos y no progresivos; sP2: espermatozoides lentos pero muy progresivos; sP3: espermatozoides muy activos y/o progresivos).
Las muestras seleccionadas presentaron mejores porcentajes de movimiento, integridad de la membrana plasmática y del acrosoma (P < 0,01), en comparación con las muestras no seleccionadas. Asimismo, la selección con Androcoll-C incrementó el porcentaje de espermatozoides muy activos y progresivos (sP3: 38,5%).
En la cuarta publicación, un total de 18 eyaculados fueron mezclados en un pool (3 eyaculados por pool) y divididos en 3 alícuotas: (i) la primera alícuota fue centrifugada y posteriormente refrigerada siguiendo un protocolo estándar (muestras control; SW- control), (ii) la segunda alícuota fue seleccionada mediante SLC con Androcoll-C y posteriormente refrigerada (SLC) (iii) la tercera alícuota fue seleccionada mediante una técnica modificada de swim-up (swim-up modificado; SU-And), con Androcoll-C y refrigerada como se ha mencionado anteriormente. Los parámetros de calidad espermática se valoraron en las muestras de semen fresco y en todas las muestras seminales procesadas (i, ii, iii) tras 72 h de refrigeración. La integridad de la membrana espermática y el movimiento progresivo fue significativamente mejor (P < 0,05) en las muestras tratadas con SU-And que en las muestras SW-control. El porcentaje de morfoanomalías disminuyó significativamente (P < 0,001) en las muestras procesadas con SLC comparadas con las muestras SW-control. Estas variables espermáticas no fueron diferentes entre las muestras SLC y SU-And (P ¿ 0,05). No se observaron diferencias significativas (P ¿ 0,05) en la tasa de recuperación para las muestras SW-control, SLC y SU-And.
3. CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral, se pueden extraer las conclusiones que se enumeran a continuación: En la primera publicación, se demostró que la refrigeración modifica significativamente tanto los parámetros específicos como la distribución de los espermatozoides dentro de las subpoblaciones cinéticas identificadas; sin embargo, la estructura general de las subpoblaciones espermáticas se mantuvo constante a pesar del efecto causado por la refrigeración.
El análisis de los cambios observados en la estructura de las subpoblaciones sugiere que las muestras que contienen un 20% de yema de huevo en el diluyente de refrigeración proporcionan una preservación más efectiva en comparación con las que contienen un 10% de yema de huevo.
En la segunda publicación, la centrifugación con Androcoll-C, empleada tras la refrigeración, permite mejorar la calidad del esperma refrigerado de perro en comparación con el resto de protocolos estudiados (muestras no seleccionadas, muestras seleccionadas antes de la refrigeración o sometidas a doble centrifugación coloidal).
La estructura general de las subpoblaciones cinéticas se mantuvo constante a pesar del efecto causado tanto por el proceso de refrigeración como por el de separación a través del coloide Androcoll-C.
En la tercera publicación, la centrifugación coloidal con Androcoll-C resultó ser una alternativa eficaz para la mejora de la calidad del semen de perro dañado por el proceso de congelación-descongelación, ya que la mayoría de los parámetros de calidad espermática explorados fueron significativamente mejores que los obtenidos en las muestras originales de esperma congelado-descongelado. Además, la Subpoblación 3 (espermatozoides muy activos y progresivos) se observó con mayor frecuencia tras la selección a través del coloide Androcoll-C.
Por último, este estudio también demostró que la crioconservación modifica significativamente la distribución de los espermatozoides dentro de las subpoblaciones identificadas; sin embargo, la estructura general de las subpoblaciones espermáticas se mantuvo constante a pesar del efecto causado por la crioconservación o la selección a través de Androcoll-C.
Finalmente, la cuarta publicación demostró que la técnica de swim-up modificada a través del coloide Androcoll-C es un método útil para la preparación de dosis seminales refrigeradas en el perro, ya que los parámetros de integridad de membrana espermática y movimiento progresivo fueron significativamente mejores en comparación con los obtenidos en las muestras originales de esperma refrigerado (muestras control).
Además, la calidad seminal de las muestras procesadas por la técnica de swim-up fue comparable a las muestras centrifugadas con Androcoll-C. Por tanto, podemos concluir que la técnica de swim-up modificada es un método más sencillo y rápido que la centrifugación en una sola capa de Androcoll-C, por lo que puede ser incluido dentro de los protocolos de preservación del semen de perro.
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