Optimización de la metodología de preservación del esperma de asno andaluz (equus asinus)
- Autores: Daniel Acha Valls
- Directores de la Tesis: Manuel Hidalgo Prieto (dir. tes.), Jesús Manuel Dorado Martín (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Moreno Millán (presid.), Francisco Crespo Castejón (secret.), Jane Morrell (secret.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:
1. introducción o motivación de la tesis La raza asnal Andaluza está catalogada actualmente como raza autóctona española en peligro de extinción (RD 2129/2008, Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España). Hasta la fecha, sólo 94 garañones están considerados como individuos de alto valor genético (DAD-IS-FAO 2013). En este contexto, es necesaria la aplicación de técnicas de reproducción asistida como la criopreservación de semen y la inseminación artificial con el objetivo de mejorar la variabilidad genética de la raza y evitar así su extinción. No obstante, consideramos imprescindible realizar un estudio previo de las características reproductivas y los parámetros seminales propios de la raza para posteriormente desarrollar y optimizar los protocolos de conservación del esperma.
Hoy en día, en el análisis de las características seminales de numerosas razas de mamíferos ha sido objeto de gran interés el estudio de las subpoblaciones espermáticas presentes en el eyaculado, observándose una correlación directa entre la presencia de determinadas subpoblaciones, la resistencia a la criopreservación, la respuesta a la refrigeración y las tasas de fertilidad obtenidas. Por lo tanto, es importante estudiar la distribución de las subpoblaciones espermáticas que conforman el eyaculado del asno Andaluz para establecer la calidad de las muestras seminales recolectadas, así como para predecir su congelabilidad y fertilidad.
Actualmente, son escasos los estudios publicados sobre refrigeración y congelación del semen de garañón, siendo inexistentes en el caso de la raza asnal Andaluza. Por ello, es necesario establecer un protocolo de preservación adecuado, así como seleccionar aquellos diluyentes y crioprotectores con los que obtener muestras seminales con buena calidad tras los procesos de refrigeración y crioconservación.
2. contenido de la investigación En la primera publicación se estudiaron las características seminales (volumen, pH, concentración, movimiento y morfología espermática) del eyaculado del asno andaluz con el objetivo de poder establecer los parámetros de normalidad propios de la raza. Asimismo, se comprobó la existencia de diferentes subpoblaciones de espermatozoides dentro del eyaculado del asno andaluz así como la influencia del individuo y del eyaculado dentro de un mismo individuo en su frecuencia de distribución. Además, se investigó la correlación existente entre la edad y el peso corporal del garañón, las características de calidad espermática y la distribución de las subpoblaciones espermáticas. Para ello, se recolectaron un total de 60 eyaculados de 12 asnos andaluces (5 eyaculados por garañón), con edades comprendidas entre los 4 y 15 años (edad media: 9,9 ± 0,4 años) y pesos corporales de 313 a 435 kg (peso medio: 381,1 ± 5,8 kg). Mediante un análisis estadístico multivariante se evidenció la existencia de cuatro subpoblaciones espermáticas (sP) con patrones cinéticos específicos: sP1, constituida por espermatozoides lentos y no progresivos (15,4%); sP2, constituida por espermatozoides moderadamente lentos pero progresivos (35,9%); sP3, constituida por espermatozoides muy activos pero con movimiento no progresivo (18,5%); sP4, constituida por espermatozoides muy activos y con movimiento progresivo (30,2%). La proporción de las diferentes subpoblaciones espermáticas existentes dentro del eyaculado no se vio afectada por el peso o la edad del garañón (P>0,05). Sin embargo, factores como el individuo, el eyaculado, el movimiento total o la concentración media del eyaculado sí influyeron significativamente (P<0,05) en la distribución de las subpoblaciones espermáticas dentro del eyaculado. Por otra parte, se demostró una correlación significativa (P<0,05) entre el peso corporal de los garañones y el pH del eyaculado, el movimiento (porcentaje de movimiento total y progresivo) y la morfología espermática. Por el contrario, la correlación entre la edad de los garañones y las características del eyaculado fue baja y no significativa (P>0,05).
En la segunda publicación se compararon las características seminales evaluadas en el espermiograma convencional así como los patrones de movimiento de las diferentes subpoblaciones espermáticas presentes en los eyaculados de asnos con diferente fertilidad, y se estableció su relación con la fertilidad in vivo. Durante el periodo experimental se recolectaron un total de 30 eyaculados de 6 asnos andaluces. La fertilidad de los garañones fue clasificada atendiendo a la tasa de gestación por ciclo, considerando a aquellos asnos con tasas de gestación por ciclo ¿ 60% como ¿fértiles¿ (n = 3) y a aquellos con tasas de preñez por ciclo < 40% como ¿subfértiles¿ (n = 3). Se observaron diferencias significativas (P<0,001) entre el grupo de asnos ¿fértiles¿ y el grupo de ¿subfértiles¿ para los valores de movimiento total y progresivo así como para la velocidad lineal. Por otro lado, se demostró que las características del eyaculado que producen un aumento significativo (P<0,05) de la tasa de gestación por ciclo son el movimiento total (r = 0,37) y progresivo (r = 0,53), la velocidad curvilínea (r = 0,44), la rectitud (r = 0,39), la frecuencia de cruzamiento (r = 0,44) y el volumen eyaculado (r = 0,53). También evidenciamos que tres de las cuatro subpoblaciones espermáticas (sP2, sP3 y sP4) existentes en el eyaculado del asno andaluz, descritas con anterioridad en la primera publicación, están significativamente (P<0,05) correlacionadas con la fertilidad del garañón (sP2, r = 0,54; sP3, r = 0,45; sP4, r = 0,56). Así, se observó una presencia significativamente (P<0,001) baja de la Subpoblación 4 en los eyaculados de los asnos pertenecientes al grupo de ¿subfértiles¿. En conclusión, este estudio demostró la relación existente entre los parámetros de movimiento espermático valorados in vitro mediante el sistema de análisis de esperma asistido por ordenador (CASA) y la fertilidad in vivo del eyaculado de asno.
En la tercera publicación buscamos seleccionar un diluyente apropiado para refrigerar semen de asno andaluz. Para ello, se evaluó la eficacia de dos diluyentes comerciales ampliamente utilizados para la refrigeración de semen equino (Gent® A e INRA 96®) para preservar semen de asno andaluz a 5ºC durante 72 horas. Además, se estudió el efecto de la incorporación en el diluyente de refrigeración de tres aminoácidos (glutamina, prolina y taurina) a diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 60 mM). Por último, se investigó la influencia de la estacionalidad en las características seminales del asno andaluz. Durante un año, 50 eyaculados fueron recolectados de un total de 10 asnos andaluces. El movimiento (mediante el sistema CASA, Sperm Class Analyzer), la morfología espermática (en muestras teñidas con Diff-Quik®), y la integridad de la membrana plasmática (Vital-Test® kit) y acrosómica (tinción doble con los fluorocromos Isocianato de fluoresceína conjugado con la lectina Arachis hipogea e Ioduro de Propidio) fueron evaluados antes de la refrigeración (muestras frescas) y tras su almacenamiento durante 72 horas a 5ºC. El diluyente Gent® A preservó significativamente (P<0,05) mejor que el INRA 96® el movimiento espermático tras 72 horas de refrigeración. La incorporación de glutamina, prolina o taurina en el diluyente Gent® A mejoró significativamente (P<0,001) el movimiento del espermatozoide de asno andaluz. Se observó una influencia significativa (P<0,05) de la estación sobre todas las características seminales evaluadas, excepto sobre el volumen del eyaculado, la concentración espermática, el movimiento total y algunos parámetros cinéticos (oscilación, linealidad, y rectitud). En conclusión, nuestros resultados demostraron la eficacia del diluyente comercial Gent® A para refrigerar semen de asno andaluz. Además, se evidenció el efecto crioprotector de los aminoácidos testados sobre el espermatozoide de asno durante el proceso de refrigeración, obteniéndose mejores resultados de movimiento espermático en aquellas muestras en las que el diluyente Gent® A fue suplementado con diferentes concentraciones de glutamina, prolina o taurina en comparación con aquellas en las que el Gent® A no fue suplementado. Por último, se demostró un efecto estacional en la calidad espermática del eyaculado del asno andaluz.
En la cuarta publicación, con el objetivo de seleccionar un diluyente adecuado para congelar semen de asno andaluz, comparamos el efecto de dos diluyentes de congelación, ampliamente usados para la congelación de semen de caballo (Gent® B e INRA 96®, este último suplementado con 2% de yema de huevo y 2,5% de glicerol), sobre la calidad espermática a la descongelación. Posteriormente, se estudió el efecto de sustituir el glicerol presente en el diluyente de congelación por otros crioprotectores de menor peso molecular: etilenglicol (EG; 1 ó 1,5%), dimetilsulfóxido (DMSO; 1,5 ó 2%), dimetilformamida (DMFA; 1 ó 2,5%) o una combinación de EG 1% y DMFA 1,5%. Para tal fin, 74 eyaculados procedentes de 10 asnos adultos fueron recolectados. La metodología para valorar los parámetros de calidad seminal antes de la congelación (muestras frescas) y tras su almacenamiento a -196 ºC fue similar a la empleada en la publicación precedente. El diluyente Gent® B proporcionó valores de movimiento espermático significativamente (P<0,01) superiores a los obtenidos con el INRA 96® modificado. La integridad de la membrana plasmática tras la descongelación fue significativamente (P<0,001) superior cuando se empleó EG 1% como crioprotector, mientras que el DMSO afectó negativamente (P<0,001) al movimiento espermático y a la integridad de la membrana plasmática. La DMFA 2,5% proporcionó los mejores resultados de calidad espermática tras el proceso de crioconservación, incrementando significativamente (P<0,001) el movimiento espermático y la integridad de la membrana plasmática. De los resultados obtenidos en este estudio podemos concluir que el Gent® B mejora la calidad espermática in vitro del espermatozoide de asno a la descongelación. Sin embargo, la sustitución del glicerol por otros crioprotectores de menor peso molecular, como el EG 1% y la DMFA 2,5%, mejora la protección del espermatozoide durante el proceso de congelación y descongelación. Además, este estudio demuestra que el uso del DMSO para criopreservar semen de asno es insatisfactorio, y se sospecha pueda tener un efecto tóxico para los espermatozoides de esta especie. Finalmente, los diluyentes de congelación evaluados en el presente estudio deberían ser incluidos en futuros estudios en los que se determine el diluyente de congelación más adecuado para cada asno.
3. conclusiONES De acuerdo a los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral, se pueden extraer las conclusiones que se enumeran a continuación:
En la primera publicación, se demostró la existencia de cuatro subpoblaciones espermáticas con patrones cinéticos específicos en el semen fresco del asno andaluz, observándose una gran heterogeneidad en la distribución de estas subpoblaciones dentro del eyaculado del garañón. La distribución de las subpoblaciones espermáticas presentes en el eyaculado no se vieron afectados por el peso o la edad del individuo. Por primera vez se estableció una correlación significativa entre el peso corporal del individuo y determinados parámetros de calidad espermática como el movimiento y la morfología espermática, así como con el pH del eyaculado. Por el contrario, ninguna de las características espermáticas se vio influenciada por la edad del asno.
En la segunda publicación, se evidenció la relación existente entre las características espermáticas evaluadas y la fertilidad in vivo. Entre los parámetros cinéticos obtenidos con el sistema CASA, se evidenciaron altos valores de velocidad curvilínea y media, así como una alta frecuencia de cruzamiento, en aquellos asnos con porcentajes de preñez por ciclo ¿ 60%. Así, el porcentaje de preñez por ciclo obtenido está relacionado con los parámetros cinéticos obtenidos con el sistema CASA. Además, se relacionó la presencia en el eyaculado de determinadas subpoblaciones espermáticas con la fertilidad in vivo, presentándose porcentajes significativamente bajos de la subpoblación con espermatozoides rápidos y progresivos (sP4) en aquellos eyaculados de asnos con baja tasa de fertilidad. Por último, nuestros resultados demostraron la importancia del empleo de las técnicas CASA para detectar diferencias sutiles de movimiento espermático entre asnos ¿fértiles¿ y ¿subfértiles¿.
En la tercera publicación, se mostró la existencia de una influencia de la estación sobre la mayoría de las características seminales del eyaculado del asno andaluz. El diluyente Gent® A proporcionó valores de movimiento espermático tras 72 horas de refrigeración significativamente superiores en comparación a los obtenidos con el diluyente INRA 96®, sugiriendo así que el Gent® A es más apropiado para preservar espermatozoides de asno a 5ºC. La adición de glutamina, prolina y taurina al diluyente de refrigeración mejoró la preservación de los espermatozoides de asno andaluz, obteniéndose valores superiores para la mayoría de variables de movimiento espermático analizadas con el sistema CASA en aquellas muestras seminales refrigeradas con el diluyente Gent® A suplementado con diferentes concentraciones de estos tres aminoácidos en comparación con aquellas muestras refrigeradas con Gent® A sin suplementar. Esta mejoría fue menos pronunciada cuando los aminoácidos se añadieron a concentraciones de 20 mM.
Finalmente, en la cuarta publicación se demostró que el diluyente comercial Gent® B proporciona valores de motilidad espermática significativamente superiores a los obtenidos con el INRA96-EYG tras la descongelación, sugiriendo así que el diluyente Gent® B es más eficaz para congelar semen de asno. La sustitución del glicerol por otros crioprotectores de bajo peso molecular, como el EG, mejoró la criopreservación del espermatozoide de asno andaluz, proporcionando una mayor calidad espermática a la descongelación. El empleo de DMSO como crioprotector fue insatisfactorio, por lo que sospechamos pueda resultar tóxico para esta especie. La DMFA al 2,5% fue el crioprotector que mejor conservó la calidad espermática durante el proceso de congelación y descongelación. La combinación de EG y DMFA a bajas concentraciones no proporcionó buenos resultados de calidad seminal tras el proceso de congelación y descongelación. Por último, aunque debe de ser determinado si una mejor calidad in vitro del espermatozoide de asno andaluz tras el proceso de criopreservación en diluyentes que contienen diferentes crioprotectores proporciona una mejoría en la fertilidad in vivo tras la inseminación artificial, ello permitiría un uso más eficiente del semen criopreservado de asno para la inseminación.
