Resumen de Clonacion de genes de citocromo p4501a1 y metalotioneina de peces y su uso como biomarcadores de contaminacion ambiental
La biotransformación de diversos xenobióticos presentes en los ecosistemas marinos está catalizada por enzimas inducibles. Esta respuesta permite su uso como biomarcadores tempranos de contaminación ambiental. Este estudio se ha centrado en el citocromo P4501A ( CYP1A) como respuesta de fase I frente a xenobióticos orgánicos y en la metalotioneína (MT) que refleja la contaminación por metales pesados. La alta homología existente entre las secuencias de ambos genes en diferentes especies de peces, permitió diseñar oligos degenerados para amplificar por PCR secuencias de cFNA de CYP1A y MT en dos especies de peces; Sparus aurata ( dorada) y Linza aurata (lisa). La obtención de fragmentos de cFNA específicos de ambos genes por RT-PCR y susecuenciación, permitió el diseño de oligo específicos para conseguir por RACE-PCR cDNAS completos que han sido clonados y secuenciados.
A partir de estas secuencias se diseñaron nuevos oligos específicos que permitieron amplificar fragmentos de 149pb y 163 pb respectivamente en MT y CYP1A.Los niveles de los correspondientes mRNAs se han medido por transcripción inversa acoplada a PCR (RT-PCR), seguida de separación por tamaño de los amplicones en un secuenciador de DNA y su cuantificación con el software "GeneScan". Se han construido patrones internos, con 6pb más en los cDNAs correspondientes, que permiten su cuantificación por PCR competitiva. Esta metodología se ha validado por exposición a contaminación modelo, b-naftflavona y CdC12. Como referencia, se ha utilizado la actividad EROD,ELISA y "Western", activación de 2-AA o determinación de metalotioneínna.
