Del gen a la patofisiología: Nuevas enfermedades asociadas al catabolismo de los aminoácidos ramificados

• Autores: Alfonso Luis de Oyarzábal Sanz
• Directores de la Tesis: Pilar Rodríguez Pombo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2016
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Fernández Piqueras (presid.), Alfredo Giménez-Cassina Sendón (secret.), Miguel Angel Martín Casanueva (voc.), Magdalena Ugarte (voc.), Belén Pérez Dueñas (voc.)
• Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular, Biomedicina y Biotecnología (Biociencias Moleculares)
• Calificación: Sobresaliente Cum Laude
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Los aminoácidos de cadena lateral ramificada (BCAAs, por sus siglas en inglés - Branched- Chain Amino Acids) son elementos clave en el metabolismo y señalización celular. Su catabolismo es un proceso eminentemente mitocondrial que empieza con una transaminación seguida de una descarboxilación oxidativa catalizada por el complejo multienzimático mitocondrial BCKDH. Los defectos en el catabolismo temprano de los BCAAs resultan en una enfermedad rara de caracter neurológico y fatal desarrollo conocida como “enfermedad de la orina de jarabe de arce” o MSUD, claro ejemplo de la importancia de su correcto catabolismo en la salud.

    A lo largo de este trabajo hemos descrito un grupo de pacientes con nuevas enfermedades asociadas al metabolismo de los BCAAs. Estos fueron referidos a nuestro laboratorio en base a su perfil metabólico en plasma y a la sospecha clínica de una metabolopatía. Basándonos en su estratificación buscamos la causa genética responsable de la patología mediante el empleo de las diferentes tecnologías disponibles para el diagnóstico genético.

    En el primer caso descrito encontramos la mutación causante de patología mediante la descripción previa de una región de pérdida de heterozigosidad que abarcaba el cromosoma 4 entero. Esto dirigió nuestra atención hacia el gen PPM1K, que codifica para la fosfatasa PP2Cm, propuesta en modelos animales como la reguladora positiva de la actividad del complejo BCKDH. Confirmamos una deleción en homozigosis de dos pares de bases en dicho gen, que causaba un cambio en la fase de lectura, resultando en la aparición a 5’ de un codón de parada prematura. El subsiguiente análisis del efecto de la mutación confirmó la relación entre la pérdida de función de PP2Cm con la disminución e la actividad de BCKDH, responsable del fenotipo de MSUD descrito en el paciente.

    En el segundo grupo de pacientes se diagnosticó un defecto en la quinasa reguladora del complejo BCKDH, la proteína BCKDK. Estos pacientes se caracterizaban por un comportamiento de tipo autista, asociado a retraso mental y de crecimento y a una disminución en la concentración de BCAAs en plasma. El primer paso para el diagnóstico fue la determinación de dicho perfil bioquímico como la firma metabólica de la enfermedad, lo que se consiguió mediante la caracterización de la tasa de metabolismo de la [U-13C]-leucina en fibroblastos en cultivo. Posteriormente caracterizamos dos mutaciones de péridida de función en el gen BCKDK, c.520C>G y c.1166T>C, responsables del fenotipo molecular descrito. BCKDK es responsable de la fosforilación e inactivación del complejo BCKDH, con lo que un defecto en la quinasa supone la activación constitutiva del complejo.

    En el caso del último paciente realizamos un estudio de Secuenciación Masiva (NGS) en el que se evaluaron las regiones exónicas codificantes de más de 4.800 genes. Mediante la aplicación de una serie de filtros lógicos encontramos una mutación en el gen BCAT2, que codifica para la transaminasa mitocondrial responsable del primer paso del metabolismo de los BCAAs.

    En la búsqueda de dianas de acción para el tratamiento de la enfermedad dirigimos nuestra investigación hacia el estudio de la función mitocondrial tras la alteración en la regulación del metabolismo (tanto por defecto en PP2Cm como en BCKDK) por diversas razones. En primer lugar, debemos recordar que el metabolismo de los aminoácidos ramificados es un proceso mitocondrial en si mismo. En suma a esto, PP2Cm había sido descrita como una proteína esencial en la función mitocondrial en modelos animales, y se han descrito alteraciones mitocondriales en la etiopatogénesis de diversos tipos de autismo, haciendo de la mitocondria un objeto interesante de estudio.

    Encontramos un incremento en la producción de O2 ·- en ambas situaciones, especialmente llamativo en los fibroblastos de los pacientes BCKDK. La valoración de las tasas de consumo de oxígeno revelaron una disminución en las respiraciones basal y asociada a ATP, que se reflejaron en una reducción en la concentración de ATP celular.

    Mediante los análisis posteriores no pudimos ratificar la implicación de PP2Cm en el poro de transición mitocondrial mPTP, tal y como se había descrito en otros modelos, pero si confimamos una relación con la sensibilidad a la supervivencia celular, registrada como un incremento en la activación de rutas MAPK y sobreexpresión de ciertos genes proapoptóticos. Con todo esto, queda aún por determinar qué elementos del fenotipo descrito se deben a los aumentos en BCAAs y cuales a la deficiencia en PP2Cm en si misma.

    Al analizar la respuesta mitocondrial al estado hiper catabólico debido a la deficiencia en BCKDK observamos mitocondrias más alargadas y con forma más tubular en los fibroblastos de los pacientes, así como un aumento en la expresión de las proteínas relacionadas con la fusión mitocondrial OPA1 y Mfn2, resultados que se reprodujeron en fibroblastos control interferidos para BCKDK. Estos resultados apuntan hacia la existencia de diversos mecanismos mitocondriales para mitigar el daño causado por el decremento en las concentraciones de aminoácidos, otorgando a la mitocondria una posición relevante en el desarrollo de la patología.

    Nuestros resultados ensalzan la importancia en el equilibrio del metabolismo de los BCAA. La descripción de nuevos genes implicados en una ruta metabólica permiten la definición o validación de una aproximación terapéutica a la enfermedad, y avala la bísqueda de nuevas dianas de acción dirigidas contra las diferencias partes de la enfermedad