Resumen de Efecto de la selección de espermatozoides mediante centrifugación coloidal sobre la calidad de las dosis de semen de asno refrigeradas y congeladas
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1. Introducción o motivación de la tesis A día de hoy, los asnos han perdido su rol tradicional, lo que ha resultado en la inclusión de las razas de asnos ibéricas en el catálogo de especies amenazadas de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO). En la actualidad, la importancia de los asnos está aumentando de nuevo y es esencial que los garañones con características genéticas más deseables puedan ser empleados para aumentar el número de individuos. La inseminación artificial con semen refrigerado o congelado es una de las estrategias más populares a la hora de enviar y preservar material genético de asnos valiosos. Sin embargo, estas técnicas dañan al espermatozoide, disminuyendo en consecuencia las tasas de gestación. En este sentido, la selección espermática mediante centrifugación coloidal de una sola capa (SLC) ha mostrado ser útil en la selección de espermatozoides con mejor calidad en distintas especies animales. Sin embargo, al inicio de la presente Tesis Doctoral, no había ningún estudio que evalúe el efecto de la SLC en semen de asno; además, no existe ningún coloide específicamente diseñado para semen de asno. Por lo tanto, es esencial valorar el efecto que diferentes coloides tienen en la calidad espermática de semen de asno refrigerado y congelado.
2.contenido de la investigación En la primera publicación se estudió el efecto de la centrifugación coloidal de una sola capa (SLC) con Androcoll-E-Large en los parámetros espermáticos de semen de asno tras 24 h de refrigeración. Para ello, se obtuvieron eyaculados de asnos de raza asnal Andaluza que se refrigeraron a 5C. La SLC se llevó a cabo transcurridas 24 h de refrigeración usando el coloide Androcoll-E-Large. En el primer experimento, todos los parámetros espermáticos analizados (movimiento total y progresivo, vitalidad, morfología espermática y parámetros cinéticos) se compararon estadísticamente entre las muestras de semen antes y después de ser procesadas mediante SLC. Los parámetros evaluados obtuvieron valores significativamente más altos (P<0,05) en las muestras procesadas mediante SLC. En el segundo experimento, las muestras de semen se clasificaron en dos grupos en función del movimiento progresivo antes de la SLC. No se encontraron diferencias significativas entre grupos, lo que indica que la SLC mejoró los parámetros de calidad espermática de todo el conjunto de muestras procesadas, independientemente de su movimiento progresivo original.
El objetivo de la segunda publicación fue determinar si la SLC mejora la calidad del semen descongelado de asno y si esta mejora potencial está relacionada con la resistencia a la congelación del eyaculado. Así, se congeló semen de asnos de raza asnal Andaluza mediante un protocolo estándar. Se analizaron y compararon los parámetros espermáticos de muestras descongeladas antes y después de ser sometidas a SLC. La calidad espermática se estimó integrando en un único valor el movimiento espermático (valorado mediante análisis espermático computarizado), morfología y vitalidad (evaluadas respectivamente con microscopía de campo claro y fluorescencia). La resistencia a la congelación espermática se definió como la relación entre la calidad espermática obtenida antes y después de la congelación-descongelación. Los eyaculados se clasificaron en grupos de resistencia a la congelación baja, media y alta usando los percentiles 25 y 75 como límites. Todos los parámetros espermáticos fueron significativamente más altos (P<0,01) en las muestras seleccionadas con SLC que en las no seleccionadas, siendo algunos parámetros cinéticos incluso más altos que en el semen fresco. El incremento de los parámetros espermáticos tras la SLC estuvo correlacionado con la resistencia a la congelación del eyaculado, obteniéndose los valores más altos tras someter a SLC las muestras procedentes de eyaculados con baja resistencia a la congelación.
En la tercera publicación, los objetivos propuestos fueron determinar la calidad espermática de las muestras de semen de asno congeladas y descongeladas tras SLC usando Androcoll-E-Small en comparación con la centrifugación simple (SW) y la no centrifugación (UDC) y valorar si el efecto en la calidad espermática tras SLC o SW depende de la calidad de la muestra. Los eyaculados congelados y descongelados de asno de raza asnal Andaluza se dividieron en tres alícuotas y se procesaron usando tres técnicas diferentes tras la descongelación: el control diluido y no centrifugado (UDC), centrifugación simple (SW) y centrifugación coloidal (SLC). Después, el índice de calidad espermática se estimó integrando todos los parámetros (movimiento total y progresivo, integridad de la membrana y fragmentación del ADN) en un único valor. Se estudió la relación entre la calidad espermática de las muestras descongeladas y diluidas (UDC) y el efecto de SW y SLC en los parámetros espermáticos. El índice de calidad espermática fue significativamente superior (P<0,001) en las muestras procesadas mediante SLC (0,8 0,0) que en las UDC (0,6 0,0) y SW (0,6 0,0), independientemente del índice de calidad espermático de la muestra tras descongelación.
En el cuarto estudio se compararon dos coloides (EquiPure y Androcoll) diseñados para semen de caballo, pero aptos también para la selección de espermatozoides de semen descongelado de asno, para valorar si hay alguna diferencia en su capacidad de seleccionar espermatozoides con buen movimiento, integridad de la membrana plasmática y mejor distribución de las subpoblaciones de movimiento espermático. Las muestras de semen se dividieron en los siguientes tratamientos: una alícuota antes de la congelación (Fresh) y cuatro alícuotas tras la descongelación: control diluido no centrifugado (UDC), centrifugación simple (SW), centrifugación coloidal usando EquiPure Bottom Layer (SLC-EquiPure) y Androcoll (SLC-Androcoll). Se compararon entre tratamientos el movimiento total (TM), progresivo (PM) y parámetros cinéticos (valorados con análisis de esperma computarizado), integridad de la membrana plasmática (IMS, evaluada mediante microscopía de fluorescencia), y distribución de las subpoblaciones de espermatozoides móviles (sP). SLC-EquiPure y SLC-Androcoll fueron los tratamientos que obtuvieron mayores TM y PM. SLC-Androcoll consiguió los valores medios más altos en la mayoría de los parámetros cinéticos, pero SLC-EquiPure mejoró la IMS. Se encontraron cuatro sP, SLC-Androcoll seleccionó un mayor porcentaje de espermatozoides pertenecientes a la sP4, es decir, los más rápidos y progresivos.
El quinto estudio se centró en la fragmentación del ADN espermático en semen de asno. La fragmentación del ADN espermático (sDF) se considera un parámetro importante a la hora de predecir in vitro la fertilidad potencial de una muestra de semen. La centrifugación coloidal (SLC) podría ser una técnica adecuada para seleccionar los espermatozoides de asno más resistentes a la fragmentación del ADN tras la descongelación. Estudios previos han mostrado que, para evidenciar el daño latente en la molécula de ADN, sDF debe ser valorada de forma dinámica, donde la velocidad de fragmentación del ADN en cada tratamiento indica cómo de resistente es el ADN al daño iatrogénico. La velocidad de fragmentación se calcula usando la pendiente de una ecuación de regresión lineal. Sin embargo, no se ha estudiado si las dinámicas de fragmentación del ADN espermático se ajustan a este modelo. Los objetivos de este estudio fueron por tanto evaluar el efecto de distintos tratamientos post-descongelación en la fragmentación del ADN espermático y elucidar el modelo matemático más preciso (regresión lineal, exponencial o polinómico) para la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo en semen de asno congelado y descongelado. Una vez sometidas las muestras a dilución (UDC), centrifugación simple (SW) y centrifugación coloidal (SLC), se observó que los valores de sDF fueron significativamente menores tras 6 h de incubación en SLC que en UDC y SW. Los valores del coeficiente de determinación (R2) fueron significativamente mayores para el modelo polinómico de segundo grado que para el lineal o el exponencial. Los valores más altos de aceleración de fragmentación (asDF) se obtuvieron en las muestras SW, seguidas de SLC y UDC.
3.Conclusiones La centrifugación coloidal de una sola capa usando Andrcoll-E-Large mejora el movimiento total y progresivo, vitalidad, morfología, así como la mayoría de los parámetros cinéticos valorados en la totalidad de las muestras de semen de asno procesadas tras 24 horas de refrigeración.
La centrifugación coloidal de una sola capa del semen congelado-descongelado de asno puede ser un procedimiento adecuado para mejorar la calidad de las muestras post-descongelación de dosis criopreservadas de esperma, esta mejora es especialmente patente en los eyaculados con baja resistencia a la congelación.
La centrifugación coloidal del semen de asno congelado-descongelado usando Androcoll-E puede ser un procedimiento útil para seleccionar espermatozoides de gran calidad en dosis de esperma de asno criopreservadas, este procedimiento es particularmente útil en aquellas muestras de semen en las que se requiera una mejora del movimiento espermático.
El coloide EquiPure seleccione espermatozoides con la membrana intacta, progresivos y relativamente lentos, mientras que el coloide Androcoll selecciona los espermatozoides más rápidos y progresivos. Se requieren futuros estudios para esclarecer qué aspectos de la calidad espermática están más relacionados con mayores tasas de gestación tras inseminación artificial.
La centrifugación coloidal post-descongelación parece preservar durante más tiempo la longevidad del ADN en comparación con la dilución sin centrifugación y la centrifugación simple. Además, el ajuste de modelos ha mostrado que las dinámicas de fragmentación del ADN en semen congelado-descongelado de asno se ajustan a un modelo polinómico de segundo grado, lo que implica que la velocidad de fragmentación no es constante y que la aceleración de fragmentación debe ser tenida en cuenta para evidenciar un daño oculto en la molécula de ADN.
