Resumen de Minocycline in inflammatory bowel disease: far beyond an antibiotic
MINOCYCLINE IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE: FAR BEYOND AN ANTIBIOTIC 1. Introducción.
El término Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) comprende dos patologías: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Ambas enfermedades se caracterizan por una inflamación crónica y recurrente del tracto intestinal, de etiología desconocida, en la que se alternan periodos de exacerbación de los síntomas, seguidos de intervalos más o menos prolongados de remisión de los mismos.
Aunque hasta el momento se desconocen los mecanismos responsables de la iniciación y perpetuación en el tiempo del proceso inflamatorio intestinal, es aceptado que en su fisiopatología están implicados factores genéticos, ambientales e inmunológicos. Así, numerosos estudios han propuesto que, en personas genéticamente predispuestas, una activación exagerada y descontrolada del sistema inmune intestinal frente a un determinante antigénico desconocido, puede desencadenar la aparición de la respuesta inflamatoria intestinal exacerbada. Esta respuesta inmunológica genera numerosos mediadores de carácter pro-inflamatorio (citocinas, eicosanoides y metabolitos reactivos derivados del oxígeno o del nitrógeno) que actúan de forma sinérgica y simultánea promoviendo la amplificación y cronificación del proceso inflamatorio intestinal.
Asimismo, son numerosos los estudios que sugieren que la microbiota entérica juega un papel clave en el inicio y desarrollo de la EII. Se propone que existe un desequilibrio en las concentraciones luminales de determinadas bacterias en pacientes con EII, proceso llamado disbiosis, de forma que el incremento en la proporción de bacterias potencialmente dañinas (E. coli enteroinvasivo, Bacteroides fragilis, y anaerobios totales) se acompaña de la disminución de bacterias potencialmente protectoras de la función intestinal (lactobacilos y bifidobacterias). El papel que la microbiota intestinal desempeña en la patogénesis de la EII se ve reforzado por numerosas observaciones. En pacientes de EII, el número de bacterias asociadas a la capa mucosa intestinal se encuentra incrementado. Además, las zonas del intestino con mayor carga bacteriana (íleon distal y colon) son los lugares más frecuentemente afectados por el proceso inflamatorio en la EII. En base a esto, el tratamiento dirigido a reducir la carga bacteriana en el lumen intestinal, mediante la administración de antibióticos (metronidazol o ciprofloxacino), ha resultado efectivo induciendo la remisión en pacientes con EII. La evidencia más contundente, deriva de modelos experimentales que muestran cómo el proceso inflamatorio intestinal que se desarrolla de forma espontánea en distintos animales transgénicos, no tiene lugar cuando los animales son mantenidos en condiciones libres de gérmenes.
Por lo tanto, una estrategia terapéutica potencialmente útil en el control de estas enfermedades consistiría en restablecer el equilibrio en la microbiota del lumen intestinal, lo que podría obtenerse mediante la administración de determinados antibióticos y/o probióticos.
En base a esto, algunos antibióticos de amplio espectro, como el metronidazol o el ciprofloxacino, han sido ampliamente utilizados en el tratamiento de la enfermedad de Crohn. Además, recientemente se ha descrito su capacidad de inducir la remisión en pacientes con colitis ulcerosa, bien mediante una triple terapia antibiótica o asociados a corticoides. No obstante, ha sido en el tratamiento de la pouchitis donde sin duda han demostrado su máxima eficacia, constituyendo de hecho unas de las primeras líneas de tratamiento. Sus efectos beneficiosos en la EII han sido clásicamente atribuidos a su acción antimicrobiana, por la que modificarían la población bacteriana del lumen intestinal, y prevendrían la adhesión y posterior traslocación de bacterias potencialmente patógenas hacia el tejido intestinal. Como consecuencia, la instauración de una respuesta inmune exacerbada se vería reducida.
Sin embargo, estudios más recientes han puesto de manifiesto que, además de su actividad antimicrobiana, algunos antibióticos pueden presentar propiedades inmunomoduladoras, afectando así tanto a la respuesta inmune innata como a la adquirida. En concreto, la minociclina, una tetraciclina semisintética de segunda generación, ha demostrado poseer propiedades inmunomoduladoras, anti-apoptóticas y anti-inflamatorias al margen de su acción antimicrobiana. Tales propiedades han resultado de gran interés en numerosas enfermedades como el acné vulgaris, la periodontitis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, asma, isquemia, y daños medulares entre otras, así como en diversas enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer, enfermedad de Huntington). Los mecanismos responsables de su actividad inmunomoduladora no son aún del todo conocidos, pero de entre sus múltiples acciones destacan su actividad antioxidante, la inhibición de distintas enzimas implicadas en el proceso inflamatorio (óxido nítrico sintasa (NOS) (Nitric Oxide Synthase), metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs) (Matrix Metalloproinase) , ciclooxigenasa (COX), fosfolipasa A2 (PLA2)) y la regulación de la muerte, proliferación y activación de células inmunocompetentes (microglia, linfocitos T, macrófagos, neutrófilos).
Es importante destacar que todas estas acciones sobre la respuesta inmune, al colaborar con su acción antimicrobiana, pueden resultar clave en el tratamiento de las infecciones, tal y como se ha propuesto en diversas afecciones sistémicas o localizadas en el aparato respiratorio. Sin embargo, son escasos los estudios que han descrito el impacto que los antibióticos pueden tener en la respuesta inmune intestinal.
Esto adquiere una especial relevancia en el caso de la EII, ya que la posibilidad de disponer de un compuesto como la minociclina, en el que se combina la actividad antimicrobiana junto con un efecto inmunomodulador, podría constituir un gran avance en el tratamiento de estas enfermedades intestinales. Sin embargo, algunos estudios han puesto de manifiesto que la supresión del tratamiento antibiótico generalmente conlleva la reactivación del proceso inflamatorio, lo que implicaría su utilización durante periodos prolongados de tiempo, suponiendo un riesgo por la aparición de reacciones adversas.
En cuanto al uso de probióticos en la EII, la evidencia más significativa viene de ensayos clínicos en los que se ha evaluado la efectividad del probiótico Escherichia coli Nissle 1917 o de la mezcla de probióticos VSL#3 y que muestran su utilidad como tratamientos para el mantenimiento del estado de remisión y la prevención de las recaídas, más que como tratamiento inductor de la remisión. Los mecanismos propuestos como responsables de los beneficios derivados de su uso en la EII incluyen: la producción de compuestos antibacterianos y la reducción del pH, acciones por las que modifican la composición de la microbiota intestinal, inhibiendo el crecimiento de bacterias nocivas; su capacidad de desplazar a estas bacterias de su sitio de unión al epitelio; la mejora de la función de barrera intestinal; y la modulación de la respuesta inmune de la mucosa del hospedador. Sin embargo, no todos los probióticos comparten las mismas propiedades, cada uno posee mecanismos de acción individuales, y es el estado del hospedador el que va a condicionar la elección de la especie o cepa óptima.
Por lo tanto, teniendo en cuenta la etiología de la EII, sería interesante desarrollar estrategias terapéuticas que reinstauren el equilibrio en la microbiota intestinal, corrigiendo así la disbiosis, y que al mismo tiempo, controlen la respuesta inmune alterada que promueve el proceso inflamatorio intestinal a largo plazo.
A pesar de que el uso combinado de antibióticos y probióticos ya ha sido propuesto en el contexto de la EII con la intención de crear con los antibióticos un nicho microbiológico que pueda ser posteriormente ocupado por los probióticos, sólo algunos estudios apoyan esta estrategia, y ninguno de ellos contempla los beneficios derivados de la modulación de la respuesta inmune.
En base a esto se propusieron dos objetivos principales:
1) Evaluación del efecto antiinflamatorio intestinal de la minociclina en distintos modelos experimentales de colitis, con la intención de estudiar el papel de sus propiedades inmunomoduladoras y antibióticas en el efecto global alcanzado. Para ello la minociclina, administrada de forma oral, fue ensayada como tratamiento preventivo y curativo en el modelo de colitis experimental por ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en ratas, y sus efectos como tratamiento crónico se estudiaron en el modelo del sulfato de dextrano sódico (DSS) (Dextran Sulfate Sodium) en ratones. De forma adicional, su acción inmunomoduladora directa se comprobó mediante estudios in vitro sobre la línea epitelial de mucosa colónica (Caco-2) y la línea celular macrofágica RAW 264.7, dos tipos celulares implicados activamente en la respuesta inmune intestinal.
2) Caracterización de los efectos derivados de la asociación del antibiótico minociclina y el probiótico Escherichia coli Nissle 1917 en un modelo de colitis experimental con recidivas inducida por DSS en ratones. Con ésto se pretende establecer una estrategia terapéutica que restaure el balance en la microbiota entérica al tiempo que equilibre la respuesta inmune, ejerciendo un efecto curativo; una vez alcanzado el estado de remisión, el mantenimiento del tratamiento probiótico actuará previniendo la reactivación del proceso inflamatorio tras la interrupción del tratamiento antibiótico. Para ello se siguió un protocolo de tratamiento curativo: una vez establecida la colitis, se administró diariamente el antibiótico durante una semana, con el objetivo de controlar el proceso inflamatorio. Tras este periodo, se procedió a administrar el probiótico, cuya administración se mantuvo hasta el final de la experiencia con la intención de mantener el estado de remisión. Dos semanas después del inicio de los tratamientos, los ratones fueron sometidos a un segundo ciclo de DSS, obteniéndose de esta forma una reactivación del proceso inflamatorio que permitiera la evaluación del impacto de la asociación en la prevención de la reactivación de la inflamación intestinal en comparación con los dos tratamientos por separado. Distintos grupos de animales fueron sacrificados a distintos tiempos (7, 14, 21 y 28 días), evaluándose la evolución del proceso inflamatorio en el tiempo.
Durante el desarrollo de las experiencias se controlaron diariamente una serie de parámetros generales, que incluyen el consumo diario de comida de los animales, la evolución del peso corporal, y la aparición de heces diarreicas y sanguinolentas por visualización de restos perianales. Tras el sacrificio de los animales, el colon fue extraído en su totalidad, se recogieron los contenidos luminales para la realización de los correspondientes estudios microbiológicos y las alteraciones intestinales fueron caracterizadas en base a parámetros macroscópicos, microscópicos y bioquímicos, evaluando el efecto antiinflamatorio intestinal de los diferentes tratamientos administrados.
El daño macroscópico fue valorado en función de la relación peso/longitud del colon. En el modelo del TNBS se asignó un índice de daño macroscópico (IDM) de acuerdo con el criterio descrito por Bell y col. (1995). Para la evaluación microscópica, las muestras de colon fueron teñidas con hematoxilina-eosina y los cambios histológicos fueron evaluados según el criterio establecido por Stucchi y col. (2000). Por último, las determinaciones bioquímicas incluyeron la valoración del estado oxidativo colónico, mediante la determinación de la actividad del enzima mieloperoxidasa (MPO), el contenido de glutation (GSH) total y la expresión proteica del enzima oxido nítrico sintasa inducible (iNOS) intestinal mediante Western blot 70. Asimismo se valoró la producción de citocinas pro-inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) (Tumour Necrosis Factor) ¿ o las interleucinas (IL) -1ß y -6 mediante técnicas de ELISA. Finalmente, se procedió al análisis de la expresión génica, mediante PCR cualitativa y cuantitativa, de distintos marcadores del proceso inflamatorio. Esto incluye citocinas como TNF¿, IL-1ß, IL-6, IL-17 e IL-2; mediadores quimiotácticos como la proteína quimioatrayente de monocitos MCP-1 (Monocyte Chemoatractant Protein), la molécula quimioatrayente de neutrófilos inducidos por citoquina CINC-1 (Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant) y la proteína inflamatoria de macrófagos MIP (Macrophage Inflammatory Protein) -2; la molécula de adhesión intercelular ICAM (Inter-Cellular Adhesion Molecule) -1; y marcadores de la función barrera intestinal como mucinas (MUC-2 y MUC-3), trefoil factor (TFF) -3, y proteínas de las uniones estrechas del epitelio como Zonula occludens (ZO) -1.
2. Resultados.
La actividad inmunomoduladora de la minociclina fue puesta de manifiesto en los estudios in vitro, en los que, a diferencia de la tetraciclina o el metronidazol, fue capaz de inhibir de forma concentración-dependiente la producción de IL-8 por células Caco-2 estimuladas con IL-1ß, así como la acumulación de nitritos en el medio de cultivo de macrófagos RAW 264.7 estimulados con lipopolisacárido bacteriano (LPS).
In vivo, la minociclina, siguiendo un protocolo de tratamiento curativo, demostró un evidente efecto antiinflamatorio intestinal en el modelo del TNBS en rata a las dos dosis ensayadas (20 y 40mg/kg), de acuerdo con la reducción, en relación a los animales colíticos no tratados, de los valores de los índices de daño macroscópico y microscópico correspondientes a los animales que recibieron este antibiótico. Sin embargo, ninguno de los otros antibióticos ensayados, tetraciclina y metronidazol, mostró tal efecto antiinflamatorio. Los grupos de animales tratados con minociclina o con tetraciclina mostraron una reducción en la actividad MPO, un buen marcador de la infiltración granulocítica que se encuentra incrementado como consecuencia del proceso inflamatorio. El estrés oxidativo fue contrarrestado igualmente por ambos tratamientos, como muestra la parcial recuperación de los niveles de glutation total, uno de los principales compuestos implicados en la respuesta antioxidante fisiológica que se vio disminuido en los animales colíticos sin tratamiento. Igualmente, ambos antibióticos disminuyeron la producción de TNF¿ e IL-1ß, dos de las principales citocinas involucradas en el proceso inflamatorio, si bien el efecto conseguido por la minociclina fue significativamente mayor que el mostrado por la tetraciclina. El metronidazol, a pesar de reducir significativamente la producción de TNF¿, no modificó ninguno de los otros parámetros estudiados. La expresión génica de mediadores quimiotácticos de neutrófilos y macrófagos como CINC-1 y MCP-1 y de la molécula de adhesión leucocitaria ICAM-1, fue igualmente reducida por las dos tetraciclinas.
Además, la minociclina afectó significativamente a la expresión del enzima iNOS, principal productor de óxido nítrico (NO) (Nitric Oxide), mediador pro-inflamatorio que juega un papel clave en la patogénesis de la EII. Asimismo, redujo la expresión génica de IL-17, citocina pro-inflamatoria crítica para el desarrollo de la colitis inducida por TNBS y fue capaz de mejorar la función barrera intestinal aumentando la expresión de mucinas (MUC-2) y otros factores esenciales para la integridad del epitelio intestinal (TFF-3).
El análisis microbiológico reveló que la minociclina también fue el único de los tres antibióticos estudiados que consiguió restablecer parcialmente la ratio entre bacterias beneficiosas (lactobacilos y bifidobacterias)/ baterías potencialmente patógenas (aerobios totales y enterobacterias), drásticamente disminuido en los animales colíticos.
Sin embargo, la administración de minociclina de forma previa a la inducción del daño no fue capaz de prevenir el desarrollo del proceso inflamatorio intestinal, a pesar de que sí que incrementó ligeramente el cociente bacteriano. Estos resultados demostrarían que su actividad antimicrobiana per se, no es suficiente para la consecución de un efecto antiinflamatorio, a diferencia de lo que se ha descrito previamente para otros antibióticos. Por lo tanto, podemos sugerir que el efecto antiinflamatorio mostrado en este modelo se debe a algo más que a una acción meramente antimicrobiana, y probablemente derive de la actividad inmunomoduladora atribuida a la minociclina.
El efecto curativo de la minociclina fue confirmado en el modelo del DSS en ratones, en el que se administró como tratamiento crónico durante 21 días, periodo tras el cual los ratones tratados con minociclina experimentaron una mayor recuperación del daño intestinal (disminución del índice de actividad de la enfermedad, menor relación peso/longitud del colon, menor score histológico), asociada a una reducción en la producción de citocinas pro-inflamatorias como IL-1ß, TNF¿ e IL-6.
En conclusión, podemos señalar que la minociclina muestra un efecto antiinflamatorio intestinal en diferentes modelos experimentales de EII, el cual puede ser atribuido a la asociación de su actividad antimicrobiana y sus propiedades inmunomoduladoras.
Una vez demostrado el efecto antiinflamatorio intestinal de este antibiótico, se procedió al estudio de los efectos derivados de su asociación con el probiótico E. coli Nissle 1917, en un modelo de colitis con recidivas en ratones, intentando reproducir la naturaleza recurrente de la EII humana, y considerando las restricciones de la administración crónica de antibióticos.
Los resultados de este estudio mostraron que la asociación de la minociclina con el probiótico presenta un mayor efecto antiinflamatorio intestinal que ambos tratamientos de forma aislada. Igualmente, la reactivación del proceso inflamatorio se vio atenuada en el grupo de animales que habían recibido minociclina seguida de E. coli Nissle 1917, de acuerdo a los menores valores de índice de actividad de la enfermedad correspondientes a los animales que recibieron ambos tratamientos.
Estos efectos fueron corroborados histológica y bioquímicamente. La asociación de tratamientos mostró una mayor efectividad al reducir la expresión génica de citocinas pro-inflamatorias (TNF¿, IL-1ß, IL-2), mediadores quimiotácticos (MIP-2, MCP-1, ICAM-1) y enzimas como iNOS y MMP-9 (enzima del grupo de las proteasas cuya expresión se encuentra altamente incrementada en el intestino inflamado). Asimismo, también provocó un mayor aumento en la expresión de MUC-3, constituyente de la capa mucosa que recubre el intestino, y de ZO-1, proteína transmembrana componente de las uniones estrechas intercelulares implicada en la preservación de la integridad del epitelio . Estos efectos fueron constatados a los distintos tiempos en que se evaluó el daño colónico. Así, tras una semana de tratamiento, la minociclina fue capaz de recuperar el tejido colónico de forma similar a como lo hizo en los tratamientos posteriores. Tras estos siete días, el tratamiento antibiótico fue interrumpido con el objetivo de ¿evitar¿ los efectos adversos de su administración prolongada, siendo sustituido por la administración del probiótico, con la que se pretendía mantener el estado de remisión así como prevenir el daño tras la reactivación. El tratamiento con E. coli Nissle 1917 fue capaz de promover la recuperación del tejido colónico, y tras el segundo periodo de inducción de colitis mediante DSS, los animales que habían recibido la asociación de los dos tratamientos experimentaron una exacerbación del daño inferior a la de los animales que recibieron cada tratamiento por separado, a la vista de los resultados de los estudios macroscópicos, microscópicos e inmunológicos. Al final del estudio, los animales del grupo que recibió ambos tratamientos, mostraron una recuperación casi completa del proceso inflamatorio intestinal.
Por último, la disbiosis que caracterizaba a los animales colíticos fue parcialmente restaurada con todos los tratamientos. Por tanto, podemos sugerir que este efecto sobre la microbiota, aunque podría influir en la consecución del efecto antiinflamatorio, no explicaría el mayor beneficio alcanzado con la asociación, sino que éste derivaría más probablemente de la combinación de las propiedades inmunomoduladoras de ambos. En conclusión, el suplemento con E. coli Nissle 1917 al tratamiento con minociclina aumenta la recuperación del daño intestinal y contribuye a prevenir la reactivación de la colitis experimental.
3. Conclusiones.
A la vista de los resultados de la presente tesis doctoral podemos concluir que: - La minociclina, a diferencia de otros antibióticos utilizados en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, ejerce un efecto inmunomodulador directo. Esto se evidencia in vitro tanto en células epiteliales colónicas, disminuyendo la producción de IL-8, como en macrófagos, reduciendo la producción de nitritos.
- La minociclina, administrada como tratamiento curativo, presenta un efecto antiinflamatorio intestinal en el modelo de colitis experimental aguda por TNBS en ratas. En este efecto participan su capacidad de restaurar el equilibrio en la microbiota intestinal y sus propiedades inmunomoduladoras. En relación a su acción inmunomoduladora, ésta afecta tanto a la respuesta inmune innata, al preservar la integridad de la barrera intestinal y disminuir la producción de citocinas proinflamatorias, como a la respuesta inmune adaptativa, mediante la inhibición de la expresión de citocinas de células T colaboradoras (Th) (T helper) 1 y Th17.
- El efecto antiinflamatorio intestinal de la minociclina también se manifiesta en un modelo de progresión crónica de colitis inducida por DSS en ratones.
- La asociación del antibiótico minociclina con el probiótico Escherichia coli Nissle 1917 constituye una buena estrategia para el mantenimiento del estado de remisión, así como en la prevención de la reactivación del proceso inflamatorio, en un modelo de colitis experimental con recidivas. La combinación se traduce en un efecto sinérgico sobre los distintos marcadores evaluados, en comparación con los efectos observados con los tratamientos aislados.
