Resumen de Respuesta inmune celular y humoral del porcino ibérico frente a la metastrongylosis
La metastrongylosis es una de las parasitosis que en mayor medida afecta al ganado porcino criado en extensivo. Esta nematodosis pulmonar, durante muchos años ha sido olvidada por las connotaciones de su ciclo biológico, y es que la necesidad de la presencia de lombrices de tierra para su transmisión, no concordaban con las tecnificadas instalaciones requeridas para la explotación de las razas porcinas precoces.
Pero el resurgimiento, con más vigor que nunca, de la cría tradicional del porcino Ibérico ha provocado que esta parasitosis esté en primera línea del panorama sanitario de las explotaciones ganaderas de porcino.
Con el desarrollo de esta experiencia, pretendemos conocer en profundidad la repercusión a nivel multiorgánico de la metastrongylosis en el ganado porcino, especialmente en la valoración de la respuesta inmune celular y humoral que desarrollaron los porcinos frente al parásito, con objeto de evaluar el grado de resistencia frente a los diferentes tratamientos seguidos en el experimento.
Para tal fin, se utilizaron 48 cerdos de raza Ibérica divididos en cinco grupos, a los que se les aplicaron diversas pautas de infección con Metastrongylus apri. Se trató de reproducir experimentalmente, diferentes situaciones de infección que pudieran darse en la naturaleza, desde infecciones simples, con 3000 L3 (Lote 1) y 1000 L3 (Lote 2), hasta infecciones con pequeñas dosis sucesivas (200+400+800 L3) y posterior reto con 1000 L3 (Lote 3). El lote 4 incluyó animales que fueron inmunizados con diferentes extractos antigénicos del parásito e igualmente, retados con 1000 L3. Finalmente, el lote 5 estaba constituido por un grupo de animales utilizados como control no infectados.
Tres animales de cada grupo fueron sacrificados en los días 0, 14, 35 y 84 postinfección.
Se realizó un estudio comparativo entre los diferentes grupos experimentales, de los síntomas, de las lesiones macroscópicas en los pulmones e hígados, de la histopatología en pulmones, hígados y ganglios, del número de larvas y adultos presentes, de su morfología y localización en el pulmón, del número de huevos eliminados con las heces y del recuento diferencial de los eosinófilos en sangre. Para completar este análisis, fueron utilizadas técnicas como el ELISA y la citometría de flujo, para poder evaluar la respuesta inmunológica humoral y celular, tanto a nivel sistémico como local.
Los primeros signos clínicos, tos, respiración abdominal o disnea, fueron registrados entre los días 10 y 12 post-infección. La intensidad y frecuencia con la que se produjeron, principalmente la tos, se correlacionó positivamente con la dosis infectiva aplicada. Así mismo, se evidenció que las reinfecciones progresivas con pequeñas dosis y la inmunización con inóculos elaborados a partir de larvas y adultos del parásito, redujeron en gran medida la gravedad de la sintomatología causada por éste parásito.
Las lesiones descritas a nivel pulmonar, como enfisema, atelectasia, neumonía o granulomas, fueron significativamente más leves en los animales reinfectados. En conjunto, las lesiones pulmonares causadas por M. apri, se pueden encuadrar dentro de una típica neumonía parasitaria con tendencia a la cronicidad. En los ganglios torácicopulmonares, en todos los grupos experimentales, se observó un proceso caracterizado por la hiperplasia e hipertrofia de los folículos linfoides, los cuales presentaron un centro germinativo muy desarrollado y una escasa corona folicular, propios de folículos muy activos. Las lesiones hepáticas más relevantes fueron las manchas de leche, que son un mecanismo de reacción del organismo frente a la migración errática de los estados larvarios.
El parásito poseyó una alta capacidad de desarrollo en el tejido pulmonar de los porcinos, especialmente en los grupos primoinfectados, en los que la tasa de recuperación osciló entre el 18-20%. En el lote de animales reinfectados, no se superó el 1%, lo cual evidenció la importante resistencia adquirida por estos, tras el contacto previo con dosis sucesivas de M. apri. Respecto al grupo de inmunizados, se observaron resultados muy similares a los detectados en los lotes 1 y 2, aunque al día 84 tras la infección, se observó una reducción del 50% de la población de vermes presentes en el pulmón.
Se comprobó que la intensidad de los signos clínicos, las lesiones anatomopatológicas pulmonares y la intensidad de parasitación fueron dosisdependiente.
La proporción hembra/macho fue significativamente superior en los animales reinfectados respecto a los primoinfectados, mostrando que el sexo predominante en los procesos parasitarios con escaso número de individuos fue el femenino. Este fenómeno señaló la importante capacidad de supervivencia de la especie parásita en condiciones adversas. La longitud de las hembras adultas de M. apri, estuvo estrechamente relacionada con su capacidad de albergar huevos, puesto que se registró una correlación positiva entre la longitud media de las hembras y la concentración de los huevos en las heces. Los valores medios de la concentración de huevos en las heces en los animales infectados con una dosis alta de L3, fueron los más elevados de todos los registrados en el resto de grupos, seguidos por los animales de los lotes 2, 4 y por último, del 3.
Además, se detectaron correlaciones positivas significativas entre el número de adultos presentes y la carga de huevos en heces.
Las lesiones más características observadas en el parénquima pulmonar fueron la presencia de áreas atelectásicas, áreas enfisematosas compensatorias y un importante infiltrado de células fagocíticas desde el 14 dpi. En las fases intermedias y finales del estudios se apreció la presencia de granulomas parasitarios, por ello el cuadro lesional definido en los pulmones de los animales infectados se encuadraron dentro de un proceso neumónico típico parasitario con tendencia a la cronicidad.
Todos los grupos experimentales presentaron el mayor número de lesiones hepáticas al día 35 tras la infección. La presentación de las manchas de leche en el hígado atiende al desarrollo de resistencia frente al parásito. Esta relación entre la capacidad de respuesta y la patogénesis hepática, se hace especialmente evidente en los animales pertenecientes al lote reinfectado, que mostraron el número más elevado de manchas de leche en el hígado.
El primer incremento significativo del porcentaje de eosinófilos circulantes se registró al día 14 post-infección. No se detectaron diferencias significativas entre los diferentes lotes experimentales, aunque, los animales primoinfectados fueron los que alcanzaron los niveles más elevados.
Los resultados obtenidos tras el análisis de las diferentes poblaciones celulares presentes en muestras de sangre periférica, ganglio torácico-pulmonar y BAL, por citometría de flujo laminar, nos han permitido realizar un estudio completo de los mecanismos inmunes celulares más importantes que se desarrollaron en los porcinos durante la infección experimental con M. apri en diferentes condiciones.
Respecto al perfil de la respuesta inmune celular desencadenada en los porcinos infectados con una única dosis (lotes 1 y 2), cabe destacar que ésta fue casi indetectable a nivel periférico. Tan sólo, se detectó un ligero incremento en la población circulante de monocitos y linfocitos T, CD8+ y ¿Á¿Â. Por su parte, los ganglios linfaticos toracicopulmonares reaccionaron mas activamente, de forma especial, la poblacion de linfocitos T CD4+. En los fluidos broncoalveolares, lo mas llamativo fue el descenso significativo de la poblacion de los macrofagos alveolares.
En los animales reinfectados, a nivel sistemico se detectaron niveles significativamente elevados de monocitos. La reaccion celular en los ganglios toracicopulmonares frente a la llegada de los estados larvarios de M. apri al pulmon, fue trascendental y eficaz, debido a que se registraron correlaciones positivas muy significativas, entre el numero de larvas totales recuperadas en los pulmones al dia 14 y los porcentajes de linfocitos T CD8+, linfocitos B y macrofagos presentes a nivel ganglionar. Respecto a las variaciones celulares detectadas en las muestras de BAL analizadas, observamos una notable participacion de los linfocitos B y de los macrofagos alveolares. Por el contrario, no se evidencio ningun cambio significativo en la poblacion de celulas T a nivel pulmonar durante la experiencia.
Los animales pre-estimulados con antigenos del parasito (Lote 4), mostraron niveles elevados de monocitos circulantes. Igualmente, se registro una importante reaccion de los linfocitos B y macrofagos, a nivel de los ganglios linfaticos toracicopulmonares.
En las muestras de BAL, se describio un incremento del 50% de la poblacion de celulas B, aunque un significativo descenso de los macrofagos alveolares.
En nuestro estudio sobre la respuesta humoral desarrollada en los diferentes grupos experimentales, se han analizado dos isotipos de inmunoglobulinas, la IgM (Tindependiente) y la IgG (T-dependiente), dentro de esta ultima, se analizaron las subclases IgG1 e IgG2. En lineas generales, los valores de densidad optica obtenidos frente al antigeno larvario durante las tres primeras semanas de la infeccion fueron mas elevados que los mostrados frente al antigeno somatico de adultos. En cambio, a partir del dia 28 post-infeccion, no se registraron diferencias significativas en los resultados detectados frente a ambos antigenos. Esto indico, que los animales reaccionaron inicialmente frente a los antigenos propios de los estados larvarios, pero el hecho de que la intensidad de respuesta entre ambos tipos de antigenos se igualase, demostro que poseen muchos epitopos en comun.
El comportamiento de la IgM no resultó decisivo en la respuesta primaria frente a la parasitación por M. apri, puesto que no se observaron diferencias significativas entre los lotes examinados, incluido el grupo control.
Sobre la disyuntiva entre IgG1/IgG2, parece evidente que ambas inmunoglobulinas fueron responsables de la respuesta desencadenada por IgG, en los animales primoinfectados. No obstante, en el lote infectado con dosis altas, la respuesta desarrollada por el isotipo IgG1 fue más intensa que la mostrada por IgG2, especialmente entre los días 21 y 49 post-infección. Lo cual indica, que la reacción de IgG frente a los antígenos de M. apri, estaba fundamentada en la IgG1.
Los animales reinfectados con dosis progresivas de L3 de M. apri, exhibieron un elevado nivel de resistencia frente al reto, aunque durante el periodo de reinfecciones previas al reto, se observó un incremento significativo de IgG e IgG1. Los niveles de ambas inmunoglobulinas continuaron subiendo durante este periodo de inmunización, pero fue a partir del día 7 post-infección, cuando se detectó un significativo aumento de los valores de las densidades ópticas medias de IgG e IgG1, principalmente frente a ASL.
Sin embargo, la respuesta de IgG2 fue muy leve durante el periodo pre- y post-reto.
El empleo de extractos parasitarios para inmunizar a los animales, provocaron el desarrollo de una fuerte respuesta de tipo Th1, debido a la predominancia del isotipo IgG2 frente a los antígenos testados. Esta inmunoglobulina podría ser responsable de la susceptibilidad mostrada por los animales del lote 4, que permitieron a los adultos de M.
apri instalarse en el tejido pulmonar.
