Resumen de Análisis mutacional del extremo c-terminal de la a-1,3-galactosiltransferasa bovina: estabilidad y catálisis
Javier Antonino Linares Pastén
- español
La a-1,3-galactosiltransferasa (a3GT) està involucrada en la biosíntesis doligosacàrids antigènics responsables del rebuig immunològic hiperagut (HAR) en el xenotransplant dòrgans danimals a humans, per la qual cosa aquesta enzima té un particular interès en biomedicina. Per altra banda, la a3GT constitueix un model enzimàtic per a estudis mecanístics i estructurals de glicosiltransferasas. Lenzim transfereix galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).
Actualment, els estudis cristalogràfics han mostrat dos tipus destructures amb diferents conformacions en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, aquesta zona està altament desordenada, però en la forma II està ben definida, la qual cosa suggereix que funciona com a tapa que tanca el lloc catalític. Aquests canvis conformacionals suggereixen que lextrem C-terminal podria tenir un rol clau en lactivitat catalítica.
En la present tesis doctoral es va abordar lestudi estructural/funcional de lextrem C-terminal des dun enfocament danàlisi cinètic destabilitat de mutants dalanina de cadascun dels aminoàcids de les posicions 358-368. Daquesta manera, la comparació entre eficiència catalítica i estabilitat enzimàtica proporcionen un mètode que permet identificar els aminoàcids que tenen un paper important en la unió de lligand o en lempaquetament estructural.
Pels mutants K359A, Y361A, V363A y R365A no sha detectat activitat, per la qual cosa aquestes posicions són fonamentals per a lactivitat a3GT. K359, Y361 i R365 interaccionen amb els fosfats del UDP-Gal, a més, K359A també interacciona amb lhidroxil 3 de la lactosa segons modelització molecular, per la qual cosa sha proposat un paper dàcid/base general a la lisina 359. Per altra banda, els mutants N367A i V368A van resultar ser de 2 a 3 vegades més actius que wt, respectivament.
Els estudis destabilitat revelen que wt i mutants de residus no involucrats directament en la interacció amb els substracts, presenten major estabilitat que aquells que segons els models moleculars i les estructures cristallogràfiques interaccionen directament amb el UDP o UDP-Gal. Per altra banda, es va trobar que la presència de UDP disminueix en mutants de residus directament implicats en les interacciones amb el UDP-Gal.
RESUMEN La a-1,3-galactosiltransferasa (a3GT) está involucrada en la biosíntesis de oligosacáridos antigénicos responsables del rechazo inmunológico hiperagudo (HAR) en el xenotransplante de órganos de animales a humanos, por lo que esta enzima tiene un particular interés en biomedicina. Por otra parte, la a3GT constituye un modelo enzimático para estudios mecanísticos y estructurales de glicosiltransferasas. La enzima transfiere galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).
Actualmente, los estudios cristalográficos han mostrado dos tipos de estructuras con diferentes conformaciones en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, esta zona está altamente desordenada, pero en la forma II está bien definida, lo cual sugiere que funciona como tapa que cierra el sitio catalítico. Estos cambios conformacionales sugieren que el extremo C-terminal podría tener un rol clave en la actividad catalítica.
En la presente tesis doctoral se abordó el estudio estructural/funcional del extremo C-terminal desde un enfoque de análisis cinético y de estabilidad de mutantes de alanina de cada uno de los aminoácidos de las posiciones 358-368. De esta manera, la comparación entre eficiencia catalítica y estabilidad enzimática proporcionan un método que permite identificar los aminoácidos que tienen un rol importante en la unión de ligando o en el empaquetamiento estructural.
Para los mutantes K359A, Y361A, V363A y R365A no se ha detectado actividad, por lo cual estas posiciones son fundamentales para la actividad de a3GT. K359, Y361 y R365 interaccionan con los fosfatos del UDP-Gal, además, K359A también interaccionan con el hidroxilo 3 de la lactosa según modelización molecular, por lo cual se ha propuesto un rol de ácido/base general a la lisina 359. Por otra parte, los mutantes N367A y V368A resultaron ser de 2 a 3 veces más activos que wt, respectivamente.
Los estudios de estabilidad revelan que wt y mutantes de residuos no involucrados directamente en la interacción con los sustratos, presentan mayor estabilidad que aquellos que según los modelos moleculares y las estructuras cristalográficas interaccionan directamente con el UDP o UDP-Gal. Por otra parte, se encontró que la presencia de UDP disminuye en mutantes de residuos directamente implicados en las interacciones con el UDP-Gal.
- English
Mammalian a-1,3-Galactosyltransferase (a3GT) is involved in the biosynthesis of the oligosaccharide antigen responsible for hiperacute (vascular) rejection (HAR) in xenotransplantation of animal organs to humans [1]. a3GT is also used as a model enzyme for studies of glycosyltransferase structure and mechanisms, as well as biocatalyst in enzymatic oligosacaride synthesis. The enzyme catalyzes the transfer of galactose (Gal) from UDP-Gal a la N-acetyllactosamyne (NAcLac), or to lactose.
Currently, there are two types of a3GT 3-dimensional structure. The previously reported form I [2] is similar to the form II [3,4], except at the C-terminal residues 358-368. The C-terminal region is highly disordered in form I but well defined in form II, suggesting that it functions as a lid that closes the active site. The conformational change at the C-terminus and the sequence conservation among other a3GT suggest that this region could have key role in the catalytic action [4].
In the present Doctoral Thesis, the study structure/function of the end C-terminal was approached by a kinetic analysis and by stability analysis of alanine mutants for each one of the amino acids at positions 358-368. This way, the comparison of catalytic efficiency and enzymatic stability provides a method that allows identification of the amino acids that have an important role in the substrate binding or in structural packaging.
For mutants K359A, Y361A, V363A and R365A no activity was detected, therefore these positions are fundamental for a3GT activity. K359, Y361 and R365 interact with the UDP-Gal phosphates, also, K359A interacts with the 3-hydroxyl of the lactose according to molecular modeling, thereby it has been proposed to have the role as the general acid/base. On the other hand, the mutants N367A and V368A turned out to be 2 or 3 times more active than wt, respectively.
The studies of stability reveal that amino acids mutants (wt including) which dont directly interact with the substrates do not present higher stability than the amino acid mutants which directly interact with the substrate UDP or UDP-Gal. On the other hand, the presence of UDP stabilizes de wt enzyme and the mutants of the amino acids that dont directly interact with the substrates, while this UDP stabilizing effect diminishes in mutants of amino acids directly implied in the interactions of UDP or UDP-Gal.
