Implementación de técnicas de secuenciación masiva para el desarrollo de nuevos algoritmos diagnósticos y bioinformáticos en distrofias hereditarias de retina
- Autores: Nereida Inés Bravo Gil
- Directores de la Tesis: Guillermo Antiñolo Gil (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Número de páginas: 190
- Tribunal Calificador de la Tesis: José-Luis Dueñas-Díez (presid.), Francisco Rodríguez (secret.), José María Millán Salvador (voc.), Joaquín Dopazo Blázquez (voc.), Berta Luzón Toro (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
Las distrofias hereditarias de retina (DHR) son un conjunto de enfermedades degenerativas y, generalmente, progresivas que se caracterizan por la afectación primaria de los fotorreceptores (bastones y conos). Se estima que este grupo de enfermedades afecta, aproximadamente, a 1 de cada 3000 personas por lo que están englobadas dentro de las denominadas enfermedades raras. Actualmente, las DHR no tienen un tratamiento paliativo ni curativo, y conducen a la pérdida parcial o total de la visión. Además, estas enfermedades presentan una elevada heterogeneidad clínica y genética, lo que complica enormemente su diagnóstico. Las nuevas tecnologías de secuenciación, conocidas como secuenciación masiva o de nueva generación (NGS), han revolucionado el campo de la genética y la genómica, ofreciendo soluciones al abordaje de enfermedades heterogéneas como las DHR, ya que permiten el análisis simultáneo de todos los genes de interés.
El objetivo de la presente tesis doctoral es diseñar, validar e implementar una aproximación para el diagnóstico de las DHR basada en paneles de genes específicos de nuestra población y un sistema personalizado de los datos generados por NGS. Con esta estrategia se pretende conseguir una tasa diagnóstica elevada que sea similar o superior a la resultante de estudios que incluyen un mayor número de genes, para poder comprobar así su costo-eficiencia. Además, esto permitiría determinar el número de casos que necesitan que su diagnóstico sea rectificado debido al solapamiento clínico de las distintas patologías, así como esclarecer el efecto de mutaciones de dudosa patogenicidad. Por otro lado, estos paneles permiten seleccionar los casos candidatos a portar mutaciones en genes no previamente asociados con las DHR, que posteriormente serán analizados por secuenciación del exoma completo (WES) para la identificación de los mismos.
En el presente trabajo se han secuenciado por NGS un total de 159 pacientes afectos de DHRs, de los cuales 20 tenían un diagnóstico molecular previo y fueron utilizados como controles positivos para evaluar la fiabilidad de las estrategias llevadas a cabo. Todas las variantes patogénicas presentes en estas muestras utilizadas para la validación del sistema fueron identificadas tras el análisis de los datos, obteniendo así una tasa de detección de mutaciones del 100%. De las 139 familias restantes que no contaban con un diagnóstico genético con anterioridad a este estudio, se consiguió diagnosticar a 94 de ellas, dando una tasa diagnóstica del 67,62%. Este porcentaje es similar e incluso superior al obtenido en otros estudios donde el número de genes analizado era más elevado, confirmando así la eficiencia de los paneles de genes específicos de población. Además, los datos generados por NGS llevaron a la rectificación del diagnóstico clínico de 26 de las 94 familias resueltas (27.66%), lo que se explica por el solapamiento fenotípico de este grupo de enfermedades. Estos resultados demuestran la alta eficiencia de una aproximación independiente del diagnóstico clínico previo para enfermedades heterogéneas. Del mismo modo, contar con este tipo de estrategias puede facilitar la identificación de nuevas correlaciones genotipo-fenotipo y ampliar el espectro fenotípico de genes ya asociados con la enfermedad.
Los diversos estudios presentados en este trabajo han permitido determinar la prevalencia de los genes mutados en nuestra población, siendo el gen USH2A el más frecuentemente mutado. Además, los resultados aquí presentados han permitido identificar un total de 51 mutaciones nuevas nunca antes asociadas a enfermedad y han llevado a cuestionar la patogenicidad de dos variantes previamente consideradas como patogénicas (p.Cys759Phe de USH2A y c.206G>A de CA4).
A pesar de que la secuenciación de paneles de genes ha resultado ser una buena herramienta para fines diagnósticos, el estudio de los casos que no han sido resueltos por esta aproximación requiere de otras estrategias que impliquen a un mayor número de regiones génicas. En este trabajo, la combinación de un panel de genes y la WES permitió la identificación, en dos familias no relacionadas, de variantes potencialmente patogénicas en un gen no asociado previamente a DHR. Estos resultados, unidos a diversos estudios funcionales realizados tanto en la presente tesis doctoral como por otros autores, nos llevó a considerar este gen como un nuevo candidato de enfermedad en humanos y, por tanto, considerar resueltas estas dos familias.
Así pues, tener un control total de las regiones diana de nuestro panel de genes nos ha permitido conocer las ventajas y limitaciones de nuestro diseño, así como hallar por nosotros mismos la solución a los problemas que nos hemos ido encontrando en la práctica y postular posibles mejoras para nuestro sistema. Además, al tratarse de un diseño personalizado hemos tenido la oportunidad de ir realizando diversas actualizaciones, basadas en los resultados obtenidos, que han ido mejorando progresivamente nuestro diseño. Del mismo modo, desarrollar un algoritmo bioinformático ajustado a las características y necesidades de nuestro proyecto nos ha permitido disponer de un sistema de análisis productivo que proporciona un control absoluto sobre la naturaleza de los datos generados por NGS y, por tanto, de la calidad del proceso, lo que es sumamente prioritario para la práctica clínica por razones médico-legales. La decisión de utilizar un sistema de análisis personalizado, basado en la combinación de paquetes de programas disponibles públicamente, en lugar de un sistema de análisis comercial, ha tenido un efecto favorable sobre la efectividad del proceso y nos ha facilitado la interpretación de los datos.
