Estratègies genètiques per a la inhibició de lapoptosi en cultius in vitro dhibridomes
- Autores: Sandra Juanola Journé
- Directores de la Tesis: Jordi Joan Cairó Badillo (dir. tes.), Joaquim Vives Armengol (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2007
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Joan Xavier Comella i Carnicé (presid.), Miguel Chillón Rodríguez (secret.), Francesc Gòdia Casablancas (voc.), Lídia Garcia Coronado (voc.), Eva Prats Miravitllas (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
En l'actualitat, la indústria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d'elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar lactivitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d'aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa l'ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, ja que s'ha comprovat que una gran part de les cèl·lules presents en aquests cultius moren per apoptosi.
La principal causa daquest tipus de mort és lesgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i lacumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula. L'apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i en conseqüència, la productivitat del bioreactor.
En el present treball, shan utilitzat les eines que proporciona la biologia molecular per tal de modificar les cèl·lules, fent-les més resistents al procés dapoptosi. Lobjectiu final és aconseguir cèl·lules que mantinguin la viabilitat durant més temps, tot i que en el medi de cultiu es donin senyals per iniciar lapoptosi. Daquesta manera es milloraria la productivitat i leficiència daquests processos.
En aquesta tesi doctoral shan proposat dues estratègies dinhibició genètiques, una que consisteix en inhibir lactuació de les Caspases, proteïnes claus en el procés dapoptosi, i laltra que es centra a nivell del mitocondri, punt on conflueixen els diferents senyals apoptòtics dorigen intracel·lular.
Entre els diferents gens assajats, els resultats més positius shan obtingut amb la proteïna BHRF-1. En canvi, lexpressió de la proteïna P35 no ha permès protegir les cèl·lules enfront l'apoptosi. Gràcies a lexpressió del gen bhrf-1 és possible retardar la mort per apoptosi dels cultius cel·lulars, augmentant així la productivitat del procés, i garantir la supervivència de les cèl·lules sotmeses durant 72 hores a condicions inductores de lapoptosi, ja sigui per raons accidentals o per situacions de limitació de nutrients o acumulació de metabòlits tòxics.
També sha observat que després dun cert període de manteniment de la resembra, les cèl·lules transfectades perden la capacitat de protegir-se contra lapoptosi, ja que lexpressió del gen antiapoptòtic sacaba silenciant. Per aquest motiu, es necessari lús de vectors que expressin el gen dinterès al llarg del temps. Els resultats obtinguts han demostrat que els vectors bicistrònics són una bona eina per modificar genèticament les cèl·lules animals ja que per una banda, permetent una integració adequada del fragment de DNA clonat i per laltra que les modificacions genètiques realitzades perdurin al llarg de temps sense la necessitat dexercir una selecció constant amb antibiòtic, aspecte molt important sobretot quan sopera en bioreactors durant períodes molt llarg de temps i es treballa amb volums propis dun bioreactor.
En els cultius en perfusió sha vist que lexpressió del gen antiapoptòtic bhrf-1 permet reduir considerablement el nombre de cèl·lules mortes en el cultiu, tot mantenint la densitat de cèl·lules viables. Aquest fet és molt important, ja que es pot allargar la durada del cultiu i en conseqüència, augmentar els nivells de producció del procés. També sha observat que aquesta disminució de cèl·lules mortes coincideix amb un alentiment del cicle cel·lular dels hibridomes, suggerint que probablement la proteïna BHRF-1 actua directament sobre el cicle cel·lular i no sobre la via mitocondrial, ja que semblaria que, en condicions anòmales (limitació de nutrients), afavoreix lentrada de les cèl·lules a lestat de quiescència (fase G0), la qual cosa impediria lactivació de lapoptosi.
Nowadays, the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of biologicals of therapeutic interest and as a model to test the activity of new drugs. It constitutes the most appropriate system to obtain complex proteins with biological activity. Nevertheless, animal cell culture has certain limitations, such as the early termination of cultures when cells activate the apoptotic program. The depletion of essential nutrients and growing factors in the medium, or increased concentrations of toxic metabolites, are common the cause for cell death. Therefore, the activation of apoptosis in bioreactors seriously compromises the productivity of the bioreactor.
In this work, hybridoma cells were genetically engineered in order to make them more resistant to apoptosis under cell culture conditions. The goal was to increase viability of cultured cells, even under adverse apoptosis-inducing conditions, in order to improve productivity of such processes. Two different strategies of genetic inhibition were adopted: inhibition of Caspase activity, and overexpression of antiapoptotic members of the Bcl-2 family.
From all genes tested, the best results were obtained with the one that expresses the protein BHRF-1. Otherwise, expression of the baculoviral P35 did not protect cells against apoptosis. Cell cultures expressing gene bhrf-1 lengthened its survival period up to 72 hours when submitted to adverse conditions leading to apoptosis. In this way death due to apoptosis was retarded when nutrients were limited or toxic metabolites accumulated in the medium; or when eventual mechanical incidents occurred. Therefore, the efficiency of the process resulted improved.
After several passages in culture, transfected cells lost their capacity to protect themselves from apoptosis, which was attributed to the silencing of antiapoptotic gene expression. For this reason, the hybridoma cells were genetically engineered with bicistronic vectors (containing an IRES element) encoding the gene of interest and a selection marker. This strategy permitted stable expression for large passage number and, moreover, long-term expression of the antiapoptotic genes even in absence of selective pressure. This is of especial importance when operating large bioreactors for long operational periods of time.
In perfusion cultures, cultures of cells expressing the antiapoptotic gene bhrf-1 exhibited reduced the number of dead cells and maintained, at the same time, the number of viable cells. This is an important achievement because it allows to lengthen the duration of the cell culture and, consequently, to increase productivity. It was also observed that this decrease in the number of dead cells coincided with a slowing down of the cellular cycle of the hybridomas, suggesting that protein BHRF-1 has a direct effect on the cellular cycle rather than in the mitochondrial pathway. It seems that in anomalous conditions (nutrient restriction) this expression facilitates the switch of the cells to a quiescent stage (phase G0), preventing apoptosis.
