Application of optical methods for the evaluation of human tissues generated by tissue engineering
- Autores: Ana Maria Andreea Ionescu
- Directores de la Tesis: María del Mar Pérez Gómez (dir. tes.), Enrique Fernando Hita Villaverde (codir. tes.), Miguel Alaminos Mingorance (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Campos Muñoz (presid.), Ana Yebra Rodriguez (secret.), Miguel González Andrades (voc.), Ángel I. Negueruela Suberbiola (voc.), Che John Connon (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
Los métodos ópticos que describen como la radiación se propaga a través de tejidos biológicos se utilizan en el campo de la medicina terapéutica y diagnostica, dado su potencial en proporcionar sistemas de control de calidad para los tejidos sometidos a trasplante. Los modelos matemáticos que estos métodos implican, representan un importante enlace entre los parámetros ópticos medidos experimentalmente y las características biomédicas relevantes del tejido biológico que se pueden extraer de estos datos para caracterizar la idoneidad y la utilidad del tejido donante. Algunos de los más utilizados modelos matemáticos en óptica biomédica son la aproximación difusa de la ecuación de transferencia radiativa y los modelos computacionales Monte Carlo. Estos modelos permiten la determinación de las principales propiedades ópticas de los tejidos biológicos, las propiedades de absorción y esparcimiento (scattering).
El efecto global de la absorción es una reducción en la intensidad de la luz atravesando el medio. Los principales compuestos responsables de la absorción de la luz en los tejidos biológicos son: proteínas, ácidos nucleícos, hemoglobina, melanina, bilirrubina y agua. En cuanto al esparcimiento, este se produce cuando las partículas cargadas en un medio se disponen en movimiento oscilatorio por el campo eléctrico de la onda incidente, y reemiten luz de la misma frecuencia que la onda primaria. Como resultado del esparcimiento, la velocidad de la luz en toda la materia es menor que la velocidad de la luz en el vacío, la relación entre estas dos velocidades siendo dada por el índice de refracción. En tejidos biológicos, el esparcimiento de la luz es causado por el tamaño y la forma de los componentes de los tejidos, tales como fibras y células, y sus índices de refracción.
Para la medición de estas propiedades ópticas de los tejidos biológicos, se han propuesto distintos métodos. En la presente Tesis Doctoral, vamos a emplear un método indirecto que implica medidas de reflectancia y transmitancia y el uso posterior de un modelo iterativo basado en una simulación Monte Carlo, para determinar las propiedades ópticas de tejidos humanos corneales y de mucosa oral generados mediante ingeniería tisular.
La ingeniería tisular es una nueva área de la biotecnología cuyo objetivo es la construcción de tejidos biológicos artificiales y su utilización terapéutica, para restaurar, sustituir o incrementar las actividades funcionales de los propios tejidos orgánicos. La generación de un sustituto biogenerado requiere tres elementos importantes: células, scaffolds y factores de crecimiento. En oftalmología, el suministro de tejidos donantes de buena calidad no cumple con la demanda, ya que más de 10 millones de personas en el mundo sufren de pérdida de la visión debido a daños producidos en la córnea. La córnea, al ser una estructura avascular representa un candidato excelente para la ingeniería tisular. Por otra parte, en odontología, la reconstrucción de los defectos que aparecen tras diferentes procedimientos quirúrgicos realizados en la región orofaríngea es difícil y los cirujanos se confrontan frecuentemente con la escasez de mucosa oral para reemplazar los tejidos extirpados. Por lo tanto, generar un sustituto artificial de mucosa oral es de gran interés con el fin de tratar los defectos del tejido causados por traumas faciales o lesiones malignas, y también como una alternativa para las pruebas in vivo de los productos de salud oral.
El éxito de cualquier sustituto artificial depende del cumplimiento de las características y funciones de los tejidos nativos. Además, las propiedades físicas, tales como propiedades ópticas y reológicas, de los sustitutos tisulares son muy importantes para poder establecer, de una manera cuantitativa y cualitativa, su adecuación para uso clínico. Por todo ello, en la presente Tesis Doctoral nos planteamos evaluar tejidos humanos generados mediante ingeniería tisular basados en fibrina-agarosa utilizando métodos ópticos. Para cumplir este objetivo general, se han planteado cuatro objetivos específicos: (1) Estudiar las propiedades reológicas de sustitutos de estroma corneal nanoestructurados y no nanoestructurados de fibrina y fibrina-agarosa; (2) Desarrollar un método óptico para la evaluación de la calidad óptica y evaluar sustitutos de estroma corneal basados en fibrina, fibrina-agarosa y colágeno; (3) Determinar las propiedades ópticas de un modelo de córnea lamelar anterior humana generado mediante ingeniería tisular basado en fibrina-agarosa; (4) Determinar las propiedades ópticas de un modelo biomimético de mucosa oral humana generado mediante ingeniería tisular basado en fibrina y fibrina-agarosa.
De acuerdo con el planteamiento de estos objetivos, se han desarrollado cuatros estudios independientes analizados en un capitulo correspondiente, cada uno describiendo los materiales y la metodología utilizados, los resultados obtenidos y su correspondiente discusión, con el fin de cumplir con los objetivos propuestos ¿ Para el estudio de las propiedades reológicas de sustitutos de estroma corneal basados en fibrina y fibrina-agarosa, los diferentes modelos de estroma corneal humano artificial se generaron a partir de cultivos primarios de queratocitos humanos obtenidos de limbos esclerocorneales procedentes de queratoplastias y scaffolds de fibrina humana y fibrina humana con una concentración de 0.1% agarosa. La mitad de estos modelos fueron sometidos a un proceso de nanoestructuración basado en la compresión plástica. Los distintos modelos de estroma corneal no-nanoestructurados y nanoestructurados fueron analizados durante ocho semanas de desarrollo en cultivo. El esfuerzo, el módulo elástico y modulo viscoso fueron determinados mediante experimentos de cizalla y tests oscilatorios.
Los resultados de este estudio demostraron que la técnica de nanoestructuración incrementa significativamente las propiedades viscoelásticas de los constructos de fibrina y fibrina-agarosa. Además, el sustituto corneal nanoestructurado de fibrina con una concentración de 0,1% de agarosa presentó valores de los módulos elástico y viscoso similares a los de la córnea nativa para todos los períodos de tiempo en cultivo analizados. Esto demuestra que el novedoso método de nanoestructuración utilizado en esta Tesis Doctoral proporciona soluciones útiles para la generación de tejidos artificiales con características reológicas adecuadas para aplicaciones en medicina regenerativa.
¿ En esta Tesis Doctoral se desarrolló un montaje experimental que permite, por medio de un método no invasivo (CTF), evaluar la calidad óptica de constructos de estroma corneal humana generados en laboratorio sin modificar las condiciones de cultivo. El uso de una pantalla de cristal líquido para presentar los patrones de barras es una técnica versátil que permite la modificación rápida y fácil de la frecuencia espacial de los mismos. La técnica es dinámica y fiable, y puede ser fácilmente implementada en laboratorio como un primer paso para el control de la calidad óptica de sustitutos corneales artificiales. Además, el uso de este método no se limita a constructos corneales, pudiendo proporcionar buenos resultados para la evaluación óptica de cualquier biomaterial translúcido.
Los materiales utilizados en este estudio fueron constructos nanoestructurados de fibrina y fibrina-agarosa después de dos y cuatro semanas de desarrollo en cultivo y geles de colagéno con y sin queratocitos humanos encapsulados en el gel y comprimidos durante uno y tres minutos. En el caso de los geles de colágeno, el análisis óptico se realizó después de diez días en cultivo.
La utilización del método CTF para la evaluación de estos constructos corneales a base de fibrina, fibrina-agarosa y colágeno nos permitió concluir que, al comparar el mismo tipo de constructos, los sustitutos de fibrina-agarosa después de cuatro semanas de desarrollo en cultivo y los geles de colágeno comprimidos durante tres minutos presentan los mejores valores de CTF. Sin embargo, dadas las desventajas de los geles de colágeno, el modelo corneal de fibrina con una concentración de agarosa del 0,1% podría ser el mejor candidato para el diseño in vitro de un modelo córnea humana.
¿ La evaluación y caracterización óptica de un modelo de córnea lamelar anterior humana generado mediante ingeniería tisular basado en un scaffold de fibrina-agarosa con queratocitos humanos inmersos dentro y una capa de células epiteliales encima, se llevo a cabo utilizando un setup experimental compuesto por una única esfera integradora y láseres de Argón y Helio-Neón, basado en el método Inverse Adding-Doubling y una posterior simulación Monte Carlo. Este modelo corneal, después de cuatro semanas de desarrollo en cultivo, presentó valores de reflectancia y transmitancia similares a los de la córnea nativa, sin diferencias estadísticamente significativas. El esparcimiento fue la propiedad óptica que afectó en mayor medida la propagación de la luz a través de este tipo de tejidos, prevaleciendo sobre la absorción. Aunque los valores de los coeficientes de esparcimiento y absorción fueron mayores que los de la córnea nativa, su comportamiento espectral fue muy similar. De acuerdo a estos resultados, y teniendo en cuenta sus adecuadas características reológicas, podemos afirmar que el modelo de córnea lamelar anterior propuesto en esta Tesis Doctoral podría ser utilizado para el tratamiento de defectos de la córnea anterior, así como para otras enfermedades de la córnea, y para la realización de pruebas farmacológicas y en investigación biomédica.
¿ El método Inverse Adding-Doubling junto con una posterior simulación Monte Carlo han sido utilizados también para la determinación de las propiedades ópticas de esparcimiento y absorción de un modelo biomimético de mucosa oral humana generada por ingeniería tisular a base de fibrina y fibrina-agarosa con y sin fibroblastos humanos encapsulados dentro. De forma análoga a lo que ocurre en los tejidos nativos, el esparcimiento fue el fenómeno más importante que afectó la propagación de la luz en este tipo de tejidos biogenerados. Los sustitutos de mucosa oral presentaron valores del coeficiente de absorción que no alcanzaron los valores de la mucosa oral nativa. Esto sugiere que los fibroblastos no sintetizaron o no secretaron una cantidad considerable de componentes capaces de absorber luz durante el periodo de tiempo en cultivo estudiado. Al comparar constructos celulares y acelulares, se demostró que las células desempeñaron un papel importante en el comportamiento de las propiedades ópticas, especialmente en el esparcimiento, siendo éstas capaces de remodelar la estructura interna de los modelos biomiméticos de mucosa oral humana. Ambos tipos de sustitutos de mucosa oral generados en el laboratorio (fibrina y fibrina-agarosa), compartieron muchas similitudes con la mucosa oral nativa en términos de esparcimiento. La caracterización óptica de los sustitutos de mucosa oral podría ser de utilidad para el diseño de modelos de propagación de la luz en la cavidad oral y para predecir daños generados durante la exposición a la luz láser usada con fines terapéuticos.
En conclusión, en la presente Tesis Doctoral se han diseñado y aplicado con éxito métodos ópticos y reológicos para la evaluación de distintos tipos de tejidos humanos generados mediante ingeniería tisular. El uso de estos métodos permite determinar propiedades ópticas (reflectancia, transmitancia, esparcimiento, absorción y CTF) y reológicas (elasticidad y viscosidad) tanto de los tejidos artificiales como de los correspondientes tejidos nativos, con el fin de establecer controles de calidad de estos tejidos para posibles aplicaciones clínicas, así como para investigación biomédica básica.
